Polyhedrin作为融合伴侣用于制备重组抗菌肽的研究.pdf

中山大学围圆圆∞0昏癌噙爨 Polyhedrin作为融合伴侣用于制备重组抗菌肽的研究 专 业：病原生物学 博士研究生： 魏泉德 导 师：余新炳教授 中文摘要 目的 抗菌肽(Antimicrobialpeptide，AMP)是具有抗菌活性的一类短肽，其水 溶性好，热稳定性高，能适应较大的pH变化或较高离子强度；AMP合成速度 快，因分子小而易扩散，对正常真核细胞几乎没有损害；AMP除有广谱的抗菌 活性外，还具有抗原虫、病毒及肿瘤细胞等广泛的生物活性。与传统抗生素不同 的是，其杀细胞机制是在靶细胞膜上形成穿孔，细菌不易产生耐药性，因而最有 希望成为“传统抗菌素”的替代品。AMP走向临床的一大挑战是如何低成本大 量生产。虽然有许多关于AMP原核表达成功的报道，但这些方法仍然受制于纯 化过程复杂、AMP酶降解及产出率低等问题而未能工业化。多角体蛋白 毒，且包涵体表达之重组多角体蛋白具有与天然蛋白质相同的特性。本研究的目 的就是用来源于苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒的Polh作为融合伴侣，利用其稳 定性及保护特性，建立一种新的低成本大量生产AMP的原核表达及纯化系统， 促使AMP早R实现工业化生产，成为商品药物。方法构建pMPLl02原核 表达重组质粒，转化大肠杆菌后，经IPTG诱导，以包涵体形式表达重组融合蛋 白Polh—GFP，对重组融合蛋白包涵体进行初步纯化，经昆虫肠道碱性蛋白酶或 02进行 分析。构建pTrcGFPuv原核表达重组质粒，仅表达GFP单体，与pMPLl 对比表达，检测细菌生长密度，荧光密度及GFP表达量。构建重组原核表达载 18，对重组融合蛋白进行Ni—NTA金属离 体pPAP，表达重组融合蛋白Polh．Hal 子亲和层析纯化，经羟胺剪切、透析、离心分离，回收抗菌肽Hal18并进行 18 作质谱进行鉴定，并测定其抗菌活性。 结果 融合蛋白Polh．GFP(分子量约58 kDa)以包涵体形式表达，表达量约占细菌总蛋白的30％，与表达单体可溶性GFP 的菌株对比，表达Polh．GFP融合蛋白的菌株呈现较高的生长密度(约1．8倍)和 GFP产出(约3．5倍)，且Polh—GFP融合蛋白显示出与天然多角体蛋白相似的特性， 即快速溶于类似于昆虫中肠内的碱性pH条件。Polh能被小菜蛾中肠碱性蛋白酶 或仪一糜蛋白酶降解，融合蛋白中的GFP以及酶消化融合蛋白后得到的GFP仍然 维持部分生物活性(发荧光)。融合蛋白Polh．Hal18(分子量约33．6 ma)也以包 18表达水平可高达细菌总 涵体形式表达。包涵体不仅提高了表达水平(Polh—Hal 蛋白之50％)，且容易纯化；金属离子亲和层析纯化后得到纯度86％的产品，产 品无抗菌活性；经过羟胺剪切，中性pH条件透析后离，15(Polh不溶于该pH条件)， 成功分离Polh与Hal18，所得到的Hal18(分子量约2kDa)粗制品纯度约25％， 有抗菌活性；经RP．HPLC纯化后得到纯度90％的Hal18，最终回收率近30％。 1 1 纯化之Hal8显示与化学合成之Hal8相同的抗G+代表株金黄色葡萄球菌及 G一代表株大肠杆菌的抗菌活性。 结论Polyheldrin是一个比较理想的融合伴侣， 它能促进宿主菌生长，还能大大简化纯化步骤，提高蛋白回收率；Polyheldrin以 包涵体的形式在E．coli中表达，但与其同时表达的GFP仍然维持部分生物活性 18，且 (发荧光)。Polh作为融合伴侣能高水平表达出有抗菌活性之抗菌肽Hal 能避免融合蛋白被酶降解，还因纯化步骤简单而达到较高的产品