柑橘溃疡病菌单链二硫键稳定重组抗体的设计构建与表达.docVIP

重庆大学 硕士学位论文 柑橘溃疡病菌单链二硫键稳定重组抗体的设计构建与表达 姓名：李蒙 申请学位级别：硕士 专业：生物学 指导教师：殷幼平 2010-04 重庆大学硕士学位论文  摘  要  中文摘要  柑橘溃疡病(Citrus Bacterial Canker Disease，CBCD)是危害世界柑橘产业的重要病害 之一，为国内外检疫的重要对象。在我国柑橘产区都有发生，南方各省尤为严重，它是 由黄单胞杆菌柑橘致病变种（Xanthomonas citri subsp.citri，Xcc）引起，病菌主要侵染 芸香科植物，以甜橙、脐橙、酸橙、柠檬等品种，危害柑橘叶片、枝梢、果实，以苗木、 幼树受害最重，造成落叶、枯梢、树势衰弱、落果等，严重影响产量和品质。可危害芸 香科数十种植物，传播途径广、传染迅速、危害严重，顽固难防。当前田间主要使用铜 基杀菌剂和抗生素制剂，但防效不佳，而对于已患病的植株则采取连根拔除，集中焚毁 的手段进行根除。目前我国正在进行柑橘非疫区建设，因此开展柑橘溃疡病菌的快速、 灵敏和准确的检测技术研究具有重要意义。 单链抗体(single chain antibody，scFv)是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片 段，分子量约为完整抗体分子的 1/6，其优越性在于可通过包涵体大量表达、易于基因 工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白，基于这些特点，重组抗体在医疗领域的应用前 景已引起广泛的关注。重庆大学基因工程研究中心利用柑橘溃疡病菌制备了柑橘溃疡病 菌的单链重组抗体及二硫键稳定性抗体，但是 scFv 的稳定性欠佳，并且容易发生聚集， 在制备过程中难以得到较高浓度的活性蛋白。二硫键稳定 Fv 抗体(disulfide stabilized Fv fragments，dsFv)比单链抗体更加稳定，但是该种抗体也具有产量很低且复性效率不高的 缺陷。为此，采用在二硫键稳定抗体 dsFv 的基础上再引入一条连接肽序列以连接 VH 和 VL 基因的方法，将这两种抗体的优点集合研发一种新型抗体，即获得了稳定性更佳 的单链-二硫键稳定抗体(single chain disulfide-bond Fv, sc-dsFv)抗体。 本研究的目的在于针对柑橘溃疡病 scFv 抗体稳定性较差及 dsFv 抗体具有的产量很 低且复性效率不高的缺陷，构建一种稳定性和复性效率都较高的新型抗体，以克服前二 者的缺陷，并为今后柑橘溃疡病菌 Xcc 的免疫诊断和防治研究提供新的工具和途径。 研究的主要内容包括：在实验室已经获得二硫键稳定抗体的基础上本研究以鼠源抗 柑橘溃疡病菌表面脂多糖的二硫键稳定性抗体 dsFv 为模板，利用重叠延伸 PCR 在重链 可变区 VH 和轻链可变区 VL 之间引入一条人类抗体重链恒定区 1(CH1)的 5’端 12 个氨 基酸的序列作为连接肽，构建重组单链二硫键稳定抗体基因，将其连接入 pET24a(+)原 核表达载体并转化入表达菌株 E.coli BL21(DE3)，经表达、复性并纯化后得到高纯度的 sc-dsFv 抗体，并对其特异性、亲和力和稳定性进行测定研究。本研究已获得主要研究 结果如下： I 重庆大学硕士学位论文  中文摘要  ① 分别以 dsFv-VL 基因和 dsFv-VH 基因为模板通过一轮 PCR 扩增，在重链可变区 VH 和轻链可变区 VL 之间分别引入一条人类抗体重链恒定区 1(CH1)的 5’端 12 个氨基 酸的序列作为连接肽，再经过一轮重叠延伸 PCR 将轻链基因与重链基因融合构建 sc-dsFv 重组抗体基因，经测序结果表明基因序列正确，连接肽序列被成功引入两段基 因之间。 ② 构建好的基因序列经酶切后连接表达载体 pET24a(+)，并转化入原核表达菌种 BL21(DE3)中。通过 IPTG 诱导，获得包涵体表达蛋白。对所表达蛋白进行 SDS 电泳及 Western blot 杂交，电泳结果显示目标蛋白分子量为 30kDa，Western blot 杂交结 果显示目标蛋白表达正确与预期构想一致，即重组抗体 sc-dsFv 成功在原核表达载体中 以包涵体形式超表达，经计算每百毫升菌液产包涵体约 0.2g。 ③ 诱导表达获得的 sc-dsFv 包涵体经盐酸胍溶解后稀释于复性缓冲液中复性，利用 Ni-NTA 柱对复性后的 Xcc-sc-dsFv 进行纯化，灰度分析表明其纯度约为 90%。 ④ 用大分子相互作用仪 (biacore)分析 Xcc-sc-dsFv 抗体的亲和力，结果表明 Xcc-sc-dsFv 对其抗原 Xcc 的脂多糖 LPS 具有较高的亲和力，结合常数(ka)为 5.31×106 M-1·s-1，解离常数(kd)为 5.53×10-2 s-1，亲和常数(KD)