中华蜜蜂中肠细胞培养及CSBV感染中华蜜蜂和意大利蜜蜂幼虫的蛋白质组分析.pdf

摘要 中华蜜蜂中肠细胞培养及CSBV感染中华蜜蜂和 意大利蜜蜂幼虫的蛋白质组分析 专业：动物学 作者：张国只 导师：韩日畴研究员 摘要 蜜蜂是重要的传粉昆虫和蜂产品生产者，也是研究衰老、社会行为和神经生 物学领域的重要模式生物。为了研究蜜蜂的疾病控制，本论文对中华蜜蜂(中蜂) 中肠上皮细胞进行了原代培养；鉴定中蜂囊状幼虫病的病原，测定了中蜂幼虫对 3种病原的取食作用，并以中蜂幼虫繁殖中蜂囊状幼虫病病毒；分析研究了中蜂 囊状幼虫病病毒感染中、意蜂(意大利蜜蜂)营养杂交幼虫的蛋白组变化。 本研究从中蜂6R龄幼虫中分离中肠上皮细胞，置于含有20％胎牛血清的 Grace培养液的48孔细胞培养板中，连续培养了20周。在培养过程中观测到了 干细胞、柱状细胞和杯状细胞三种类型的中肠细胞，并且干细胞分化形成了柱状 细胞和杯状细胞。尽管细胞也有繁贿，但是细胞数量在3周后仅为仞始细胞数量 之间。在细胞培养物中添加细胞生长因子肝素(heparin)和20HE未能增加细胞 数量和提高分化比率。培养过程中发现了类围食膜状的分泌物质。这是首次对蜜 蜂中肠上皮细胞成功进行的原代培养。 中蜂囊状幼虫病是蜜蜂最为常见的一种病害。本文采用电镜观测、RToPCR 和核酸序列测序比对三种方法，鉴定了中蜂囊状幼虫病(CSBV)病原。以带荧 luminescensH06和CSBV 光基因的大肠杆菌、昆虫病原线虫共生菌Photorhabdus 病毒原液饲喂中蜂2F1龄幼虫，发现蜜蜂幼虫可取食这些病原。这可能是蜜蜂在 摘要 幼虫期易感染病害的原因之一。为了繁殖中蜂囊状幼虫病病毒，在实验室条件下 以CSBV饲喂2日龄中蜂幼虫，饲喂2，4，6，8h的幼虫在培养24h后死亡率分 别为8．3％、16．7％、58．3％和58．3％，72h后死亡率分别为75．O％、66．7％、100％ 和91．7％。 本研究还分析了营养杂交(中蜂王浆饲喂意蜂幼虫或意蜂王浆饲喂中蜂幼 虫)的中、意蜂3日龄幼虫蛋白表达图谱。结果表明，营养杂交可改变蜜蜂幼虫 的蛋白表达。比较营养杂交的中蜂3日龄幼虫的蛋白图谱可知，差异蛋白点为4 个(营养杂交后3个消失，1个出现)，上调蛋白点(3倍以上)为5个，下调蛋 白点(3倍以上)为11个，差异蛋白点的质谱鉴定表明，消失的蛋白分别为肌 动蛋白、泛素缀合酶2(E2)和变态化学趋向蛋白(ehe．3)，出现的蛋白为转录 剪接因子(SF2)。比较营养杂交的意蜂3日龄幼虫的蛋白图谱可知，差异蛋白点 为11个(营养杂交后6个消失，5个出现)，上调蛋白点(3倍以上)为8个， 下调蛋白点(3倍以上)为10个，差异蛋白点的质谱鉴定表明，消失的蛋白分 别为Hsp5、分子伴侣TCP．1、硫氧还蛋白过氧化物酶l、转录延伸因子2(EF．2)、 延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)和1个未知功能蛋白，出现的蛋白分别为线粒 体节果酸脱氢酶、鸟氨酸转氨酶和3个未知功能蛋白。 本研究还测定了CSBV感染的中、意蜂营养杂交3同龄幼虫的蛋白图谱的 变化。比较中蜂3同龄幼虫(中蜂王浆培养)和CSBV感染的3同龄幼虫的蛋 白图谱可知，差异蛋白点为7个(CSBV感染后1个消失，6个出现)，上调蛋 白点(3倍以上)为16个，下调蛋白点(3倍以上)为28个，差异蛋白点的质 谱鉴定表明，CSBV感染后1个未知功能蛋白消失，CSBV感染后出现的蛋白分 蛋白、空泡H+-ATP酶和过氧化物酶。比较中蜂3同龄幼虫(意蜂王浆培养)和 CSBV感染的3同龄幼虫蛋白图谱可知，差异蛋白点为4个(CSBV感染后2个 消失，2个出现)，上调蛋白点(3倍以上)有9个，下调蛋白点(3倍以上)有 14个，差异蛋白点的质谱鉴定表明，CSBV感染后消失的蛋白为Hsp60和1个 蛋白分析表明，空泡H+-ATP酶和AGO蛋白可能与病毒感染有关。 比较意蜂3日龄幼虫(中蜂王浆培养)和CSBV感染的3R龄幼虫的蛋白 摘要 图谱可知，差异蛋白点有15个(CSBV感染后8个消失，7个出现)，上调蛋白 点(3倍以上)有25个，下调蛋白