噬菌体表面展示技术用于对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白的研究.pdf

摘要 对虾白斑综合症病毒(WSSV)是养殖对虾的一个主要病原，严重阻碍对虾养殖 业的发展。WSSV基因组全序列的测定为其侵染机理的研究奠定了基础，其基因组 学的研究重点正转向功能基因组学，即对其众多基因产物的解析。病毒的吸跗蛋 白作为病毒最先与宿主发生相互作用的蛋白，启动病毒的整个侵染过程，在病毒 的生殖周期中发挥着相当重要的作用，也成为病毒防治的一个热点。WSSV的吸附 attachment 蛋白(Virus protein，VAP)的基因至今还未完全定位。WSSV已定位其 基因的囊膜蛋白中的两种，VP28据报道在病毒入侵中发挥重要作用，可能是WSSV 的一个吸附蛋白：另一定位的囊膜蛋白VP281序列分析中含有一细胞吸附序列 (cellattachment sequence)，可能在病毒吸附中发挥作用。本研究对此2个蛋 白进行噬菌体表面展示，确认其对宿主的吸附活性。另外通过对WSSV全序列的分 析．找到数个可能的编码囊膜蛋自的开放阕读框(ORD，分剐对其进行展示，分析 其对宿主细胞的结合活性。 用纯化的WSSV病毒粒子免疫新西兰大白兔，制备了WSSV的多克隆抗血清， 用于病毒蛋白的定位。从对虾组织提取细胞膜粗膜制剂，包被96孔板，用地高辛 标记的WSSV病毒与之结合，用酶标的抗地高辛抗体显色系统对其进行检测，确定 其结合关系。以肝胰腺细胞膜、肌肉细胞膜、大肠杆菌包板作为阴性对照，结果 显示病毒只与其敏感组织虾鳃细胞膜有明显特异性结合现象；未标记病毒与标记 病毒竞争结合虾鳃细胞膜．证实了WSSV与虾鳃细胞膜闻的特异性结合关系，显色 反应的强弱指示结合活性的大小。绕过组织培养，建立了一个评价病毒粘附蛋白 及虾受体蛋白结合活性的方法。虾细胞膜在变性条件下(SDS—PAGE)丧失病毒结合 活性，提示此受体蛋白活性的结构依赖性。 1的基因进行了噬菌体表面展示。 对两个已经鉴定的WSSV囊膜蛋白VP28、VP28 Premier软件 在WSSV全基因组中，针对VP28，VP281基因特定位点，用Primer 分别设计了一对引物，并引入NotI，SfiI酶切位点，PCR扩增后，酶切、连接于 5E，转导￡c01／TGi，用辅劝噬蕾体肼13K07进行 噬菌体表面展示载体pCANTAB 原性。外源基因片段都得到了表达，VP28、VP281都保持较好的抗原性：展示的 明VP28、VP281可能不是WSSV的吸附蛋自。 分析WSSV全基因组序列，从中选取8个可能编码囊膜蛋白的开放阅读框 ORF的重组噬菌体进行筛选，筛选出表达E-tag序列，即展示外源片段的重组噬菌 体；展示ORF的重组噬菌体与包被于酶标板的虾鳃细胞膜进行结合实验，筛选出 能与虾细胞膜结合的ORF的重组子：用能与虾鳃细胞膜结合的ORF展示产物与地 高辛标记的WSSV竞争结合虾鳃细胞膜，看是否能竞争病毒与虾鳃细胞膜的结合。 窖 鳃细胞膜的结合活性，用此4个展示的ORF与WSSV竞争结合虾鳃细胞膜，其中只 有ORFI#表现出竞争结合活性，提示此ORF可能编码WSSV的一个吸附蛋自。 用展示ORF的重组噬菌体感染叵coli 提取质粒鉴定插入片段，对阳性克隆进行增值，IPTG诱导表达。提取表达细胞的 序列的表达情况；用骼sV的多克隆抗体对表达的蛋白进行定位。ORFI#能成功检 的蛋白条带：用病毒多克隆抗体对其定位，未检测到阳性结果。其余ORF未检测 有两个TATA 编码蛋白的理论分子量为30．25KD。蛋白序列分析的结果发现其有烷基化、磷酸化、 N糖基化等蛋白修饰位点。 本研究把噬菌体表面展示技术应用于WSSV囊膜蛋白的研究，证实已报道的 毒吸附蛋白的ORF，对其蛋白序列分析，存在潜在的蛋白修饰位点。 9 di usedin Phage theWSSV spIay