外套细胞淋巴瘤bcl1IgH基因重排及其分子机理的研究.pdfVIP

浙江大学博士学位论丈 孙丈信 排的PCR引物，使之适用于临床工作，为MCL的明确诊断提供依据。 沙色体易位弓’起的基因重排非“，奇金淋巴的‘特殊亚型有芜并在其病理发 展过程中起重要作用。虽然t(i1;14)(q13;q32)染色体易位是外套细胞淋巴瘤 的特征性细胞遗传学改变，但其引起bcl-1/IgH基因重排的分子机理仍不清楚。对 同样涉及1402的t(14;18)(432:q2t)染色体易位的研究进行得比较深入，该 易位一直被认为是发生在前体B细胞发育过程中IgH基因重排时的起始阶段，即 D-Jw重排，由重组醉的错误所致。因而，推断bcl-1/IgH基因重排可能也是正常的 前体。细胞发育时，-D-J重组过程中发生错误所痴为了进一步了解bcl-1ngH基因 重排发生的确切机理，本研究的第二部分对bcl-1ngB基因重排连接区的序列进行分 析，对bcl-1区域内MTC段的断裂点，bcl-1/IgH基因重排发生时所涉及的J基‘因， 基因重排发生后连接区内的重组修饰子及D基因的同源序列加以辨认。希望通过对 其机理的研究，进一步了解它的发生、发展机制，从而为寻找更好的诊断和治疗手 段打下基础。 {方法:本组研究用的标本来自’987年到’99“年间德国病理协会下属的基尔 火 lymphnode-registry。所有28例病例的诊断都符合外套细胞淋巴瘤的形态学诊断标 准。取其新鲜冰冻的淋巴结 (保存于液氮)，其中7例还有福尔马林固定的石蜡包 埋切片作为实验材料。根据GenBank提供的序列，重新设计了针对bcl-1的引物 主〔 要是将J。引物设计为共义引物，在Pott引物的5端加上CT两个碱基，对bcl-1 内侧引物则采取更靠近断裂点处 ((205-220)的序列设计等)，分别采用半巢式PCR 和GENESCAN对上述标本进行bcl-1/IgH基因重排检测。并进一步对bcl-1/工gH基 因重排产物进行克隆和序列分析，寻找bcl-1区域内MTC段上的断裂点，bcl-1/IgH 基因重排发生时所涉及的Je基因，以及对重排发生后连接区内的重组修饰子和D基 因的同源序列加以辨认。 结果:通过GENESCAN，在28例新鲜冰冻组织中共有19例测得有bet-1/IgH 浙江大学博士学位论丈 孙文佑 基因重排，其扩增产物的大小在69-162bp间，荧光强度在500-6200间，3个病例 (例13”和”)检测到两条特异的扩增带。而采用常规的半巢式PCR，则在17例 病例中测得有bcl-1/IgH重排，扩增产物的大小在90-160bp间:在7例福尔马林固 定的石蜡标本中，6例测得有bcl-1/IgH基因重排，除一例外，5例扩增产物的大小 与新鲜冰冻组织的扩增产物大小相同。而采用文献报道中的两组引物，一组无法检 出，而另一组，也仅有一例检出。 对17例bcl-1/IgH基因重排产物进行克隆和测序，共得到18个阳性结果(其中 例，3得到2个阳性结果。经序列分析后发现，bcl-1/IgH基因重排产物为74162bp 大小，融合基因连接区为6-24bp大小。与GenBank中的bcl-1MTC(Major TranslocationCluster)区域 序〔列号为x74150)的序列比较后发现，断裂点集中在 65bp的范围内，共有10个不同的断裂点，4个阳性扩增产物的断裂点发生在位点 494上，3个发生在437和440位点上，2个发生在486位点上，其他的各有1个 发生在430,429,451,492,477和441上，其中的五个断裂点，486,430,440, 451和492未见有文献报道。而与JH基因(序列号为x97051)的比较发现，最常涉 及的几基因为J砂,共8/18个，其次为JH5，共3/18个，接下来依次为JH4/JH5,2/18 个，J6,2/18个，JHI,2/18个和JH3,1/18个。在bcl-1-MTC区域内找到了一些 和Ig基因重组时所需要的潜在修饰子高度同源的核酸序列，有重组信号序列 (RSSs),DIR基因，bp45和4bp非同源重组DNA(5-CCAG-3，或它的互补序列 5-CTGG-3)。此外，还在两例bcl-11IgH基因重排中找到了D基因的同源序列，为 同一同源序列，分别与D3基因的DXP-4,DXP-1和D3-22同源。今 结论:本研究设计的这组引物具有很高