伪狂犬病毒TKGFP突变株与gB，gD内吞基序突变体构建以及Tn7介导BactoBac系统建立.pdf

新疆大学硕士论文 摘要 伪狂犬病毒(pseudmbicsvirus,PRV)是引起多种家畜和野生动物伪狂犬 kb的线性 病的瘸原体。PRV属疱疹病毒科，a疱疹病毒亚科，基因组为约150 双链DNA。PRV具有宿主范围广、不感染人、可供外i磋因插入或替代的非必 需基因位点多以及插入外源基因容量大等特点，在构建动物病毒载体方面具有 明显优势。缺失PRV毒力基因，将外源保护性抗原基因插入PRV基因组表选 构建基因工程缺失疫苗和多价疫苗是目前伪狂犬病防治研究的热点。目前PRV 疫苗存在的—个问题就是，尽管可以抑制疾病的爆发，但是不能抵抗病毒的感染， 所以免疫之后的家畜仍然可以携带并传播病毒。这主要是由于PRV在长期的进 化过程中形成了多种逃避宿主免疫系统的机制。研究发现，作为疫苗开发中主要 抗原的gB和gD蛋白襁『商毒免劳数彀耀中兵徽的促进f仁用，这包括两个 方面：(1准皿和gp都可以促进抗体诱导的细胞表面的病毒糖蛋白的内吞作用； (2)妒还促进了病毒在细胞间的直接传播。上述功能的发挥与其胞内区含酪氨酸 的基序YXXO密切相关，该结构的突变可使典丧失EU勘能。另外，PRV也是 疱疹病毒的—个重要模式病毒。PRV功能基因组学的研究对理解疱疹病毒复制 和致病的机理具有重要意义。然而，由于疱疹病毒结构非常复杂，对其进行系统 技术为疱疹病毒等的遗传学研究开辟了新的道路，使得对病毒基因组进行系统的 遗传学分析成为面稽＆。尽管如此，含有疱疹病毒的基因组的BAc往往很大，不 能采用酶切、连接等常规的技术操作，所以基因工程改造仍然相当困难。 本研究分为E吓三个方面： 首先，为了构建PRVTK-／GFP突变体’首先提取伪狂犬病毒∞w煳北昧基 列设计了两对引物，分别扩增出位于UL23分别扩增出位于UI．23即胸苷激酶 TK，下游同源臂长度为包括部分TK及部分UI．22，上游同源臂和下游同源臂的 V 新疆大学硕士论文 完整的基因表达盒插入pSK-1781．1968的上游同源臂和下游同源臂之间构成转 移载体pSK△TK6。提取pSK△TKG质粒，经单酶切线性化后用脂质体转染 后在细胞培养液中加入5．溴脱氧尿嘧啶(BfdU)筛选的重组病毒。最后通过蚀斑纯 化获得PRVTK-／GFP突变株。依据缺失区域两侧序列设计引物，PCR结果证实 了TK的缺失与GFP表达盒的插入。这为进一步开发病毒疫苗载体提供了基础。 其次，为了研究gB和gD胞内区Y)。(中基序的功能以及对这两种抗原免 疫效果的影响，首先设计两对引物分别扩增出PRV湖北株的gB和gD基因，并 bp编 克隆到真核表达载体pcDNA3．1+上。测序结果显示庐基因全长为2751 bp编码402个氨基酸。然后依据测序结 码916个氨基酸，lp基因全长为1209 果，再设计针对胞内区YXXO基序的；菠引物，通过PCR或重叠PCR获得gB 和lp基因的Y)Ⅸo基序突变体，并将各突变体克隆到pcDNA3．1+上。通过酶 YXX4)基 切和澳l序证实获得了与预期相同的突变体。这为进—步研究班，gD 序在免疫逃趣中的作用，以及开发更力隋效的疫苗奠定了基础。 最后，为了利用Tn7介导的转座快速构趣组PRV，首先设计两对引物， SK+载体上，然后将 分别扩增出上游同源臂和下游同源臂，克隆至pBluescript lacZ a-mini．．attTn7插入两同源臂之间，获得转移载体。在大肠杆菌内，通过同源 重组将lacZ 与Pp基因问的非转录区，获得重组BAC pBeckerZFl。测序结果显示／acZ口 -mini-attTn7插入位点位于gG基因的polyA转录终止信号下游44bp，以及gD 基因的麟转录起始信号上游23bp处，不造成任何病毒基因和功能元件