系统性红斑狼疮患者骨髓基质细胞因子表达及对免疫功能的影响.DOCVIP

临床医学论文-系统性红斑狼疮患者骨髓基质细胞因子表达及对免疫功能的影响 ?????????????? 作者：邹外一 童秀珍 蓝惠霞， 冯炼强， 彭辉， 尹培达， 罗绍凯? 【摘要】? 【目的】 研究系统性红斑狼疮（SLE）患者骨髓基质细胞因子表达情况，及其对外周血淋巴细胞增殖反应的影响，探讨SLE的发病机制。【方法】 采用ELISA方法观察SLE患者骨髓基质细胞培养液IL-6、MIP-1、IFN-γ、TGF-β等细胞因子的表达，采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT），观察基质细胞培养上清液对外周血淋巴细胞增殖反应的影响。【结果】 SLE患者骨髓基质细胞培养液IL-6、MIP-1、IFN-γ浓度明显增高，TGF-β则降低，3种细胞因子与SLEDAI评分相关；正常人及SLE患者骨髓基质细胞上清液均对刀豆蛋白A诱导的外周血淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，而SLE患者的上清液抑制作用明显低于正常人；在分别加入抗MIP-1、抗IFN-γ单抗后，骨髓基质细胞上清液对外周血淋巴细胞增殖的抑制作用明显增强，而加入抗TGF-β单抗后，抑制作用明显减弱。【结论】 SLE患者骨髓基质细胞对外周血淋巴细胞增殖的抑制作用较弱，与其部分细胞因子异常表达有关，骨髓基质细胞可能与SLE的发病、发展有一定关系。 【关键词】? 红斑狼疮，系统性； 骨髓，基质细胞； 细胞因子； 淋巴细胞 ????? 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)目前病因尚未完全阐明，一些研究发现部分SLE造血干/祖细胞存在异常[1]，仅此并不能完全解释SLE的发病，引起干/祖细胞异常的机制也未明确。骨髓基质细胞分泌细胞因子除参与造血外也可参与免疫炎性反应，对免疫活性淋巴细胞的前体细胞起重要的作用。除干/祖细胞异常外，SLE患者的骨髓造血微环境是否存在异常？相关文献报道较少。我们采用双抗体夹心ELISA及四甲基偶氮唑盐（3-4,5-dimethylthiazolyl-2,2,5-diphenyl tetrazolium，MTT）比色法，观察SLE患者骨髓造血微环境中的基质细胞培养上清液几种细胞因子的表达情况及其对淋巴细胞增殖反应的影响，探讨SLE患者骨髓微环境是否有助于疾病发展或复发，进一步阐明SLE发病机制，并为探索新的治疗措施提供理论依据。 ??? 1?? 材料与方法 ??? 1．1?? 研究对象 ??? 所有病例来自中山大学附属第一医院2004年3月至2005年4月住院病人，正常骨髓15例，男性2例，女性13例，年龄21～52岁，中位年龄32岁，取自心胸外科患者手术切除的肋骨；原发性血小板减少性紫癜或/和自身免疫性溶血性贫血15例，男性2例，女性13例，年龄17～38岁，中位年龄25岁；SLE 30例均符合美国风湿学会SLE诊断标准[2]，SLE活动指数评分[2]（SLEDAI）5～25分，平均12.6分，SLEDAI＞9分为活动组，共18例，男性2例，女性16例，年龄13～53岁，中位年龄31岁，SLEDAI 11～25，平均16.1；SLEDAI≤9分为非活动组，共12例，男性2例，女性10例，年龄15～54岁，中位年龄24岁，SLEDAI 5～9，平均7.3。 ??? 1．2?? 方?? 法 ??? 1．2．1?? 骨髓单个核细胞的制备?? 所有病例均取髂前上棘或髂后上棘，用含肝素的注射器抽取骨髓12~15 mL置于含肝素40 U/mL的无菌试管，正常对照组肋骨用咬骨钳挤出骨髓成分，用1640液彻底冲洗骨髓腔，将骨髓细胞收集在灭菌离心管内，反复冲打使骨髓细胞充分分散，加等量1640液稀释，叠加于淋巴细胞分离液上，2 000 r/min(r=15 cm)，离心20 min，吸取单个核细胞层，用1640液洗涤2次，然后配制成骨髓单个核细胞悬液，计数调整细胞数为2×106 cells/mL。 ??? 1．2．2?? 骨髓基质细胞层建立?? 液体培养体系中含200 mL/L胎牛血清， IMDM、青霉素100 U/ mL，链霉素100 U/ mL，氢化可的松10-6 mmol/L，骨髓单个核细胞 5×105 cells/mL，置于6孔培养板中，每孔4 mL，每份样本设置3个复孔，37 ℃、饱和湿度、体积分数5%CO2条件下培养，3 d后弃去全部上清及悬浮细胞，补充等量的上述体系培养液（不含细胞），之后每周半量换液1次，第3～4周当贴壁细胞铺满约85%～90%培养板底时，吸弃上清，用PBS洗涤2次，加等量上述体系培养液，添加终浓度为5 μg/mL PHA-P刺激，继续培养3～4 d，收集上清，保留待检。 ??? 1．2．3?? 骨髓基质细胞培养上清液细胞因子测定? 采用固相双抗体夹心ELISA法测定细胞培养上清液白介素-6（Interleukine