PCR法鉴定变形链球菌与远缘链球菌的研究.pdfVIP

中 文 摘 要 前 言 龋病是一种感染性疾病。其中变形链球菌(Streptococcusmu- tans，简称变链菌)和远缘链球菌(Streptococcussobrius)，与人类龋 病密切相关。与变链菌相比，远缘链球菌具有更强的致龋潜力，对 龋病的发生和活跃性可能更为重要，因此准确的对口腔中这两种 细菌做以鉴别及鉴定，对龋病的病因研究具有重要意义。近年来， 国外学者就致龋毒力因子进行了较深人的研究，变链菌dex基因 的DNA探针和PCR引物已被用于变链菌的检测，而远缘链球菌 dex基因的PCR引物则未见报道。国内用PCR法鉴定变链菌及 远缘链球菌的研究尚属空白砰本研究在国内首次应用PCR法扩 增变链菌的Ingbritt血清型C)及远缘链球菌的UAB66血清型 g)的dex基因，用来检测及鉴定这两种细菌，为探索变链菌、远缘 链球菌在龋病中的作用提供手段。 材料与方法 选取四个幼儿园中的4-5岁婴幼儿猛性龋儿童30名，采样 时间均为上午8一10时，由同一检查者完成。每人取非刺激性全 唾液不少于3ml，在微量震荡器上震荡30秒后，部分接种于 TYCSB培养基上，在37℃条件下培养48小时后，进行次代纯培 养，将纯培养细菌做生化鉴定以初步鉴定变链菌及远缘链球菌，细 菌DNA的提取使用酚一氯仿法 ;另一部分唾液样本直接提取 DNA。采用引物M:一M2:5-TATGCTGCTATTGGAGGTTC- 3,5’一AAGGTT GAGCAATTGAATCG一3;S,一S2:5，一GGT ·1 · CTACATCTCCAATGCCA一3,5‘一TAGCCTTAGAGTCTC CTTGC一3’以细菌DNA为模板，进行PCR扩增，反应物加样于 1.5%的琼脂糖凝胶电泳上，嗅乙咙染色紫外灯下观察结果。 结 果 所有变链菌株仅在1,200bp处有一条扩增带，而远缘链球菌 株仅在700bp处有一条扩增带。4份唾液标本经TYCSB培养，增 菌后可以检测出远缘链球菌，6份唾液直接提取菌体DNA可以检 测出远缘链球菌。 讨 论 对变链菌及远缘链球菌最基础的鉴定是根据形态及特殊生化 实验，虽然较为简便、直观，但只能初步鉴定变链菌及远缘链球菌， 不能把二者完全分开。免疫化学技术中虽较生化方法及形态学鉴 定有更大准确性，但应用范围不广。尽管DNA探针技术特异性 强，但耗时长，且方法复杂。PCR法是近年来才发展起来的技术， Igarash于19%年首先应用dex基因(变链菌Ingbritt株)合成两条 寡核昔酸引物，对从口腔中可以分离出来的G球菌、G杆菌、G- 球菌，G一杆菌60株进行扩增，结果仅有8株变链菌出现1,200bp 的扩增带，而其它细菌均无此条带。说明此引物可以把变链菌从 口腔其它细菌中鉴别出来。Igarash在此实验中应用的引物可检 测出lpg的DNA染色体，相当于12CFU/ml细菌。HIda等于 1999年应用dex基因(远缘链球菌UAB66株)用PCR法制备了鉴 定远缘链球菌的探针，亦可以把远缘链球菌从口腔其它细菌中鉴 别开来。国内学者仅就dex对牙菌斑形成的影响做了探讨，而应 用dex基因进行ms种属间的鉴别尚属空白。本实验应用上述两 种四条寡核昔酸引物，对变链菌和远缘链球菌标准株进行了扩增， 变链菌在1,200bp处有一条扩增带，远缘链球菌在700bp处有一 条扩增带，结果与文献报告相符，达到预期指标。从而证明，dex 基因可以从口腔中分离并鉴定出变链菌和远缘链球菌。 本实验又以从唾液中直接提取的细菌DNA与经TYCSB琼脂 选择培养增菌后提取的细菌DNA为模板，行PCR。结果表明，有 两份唾液样品培养后，远缘链球菌检测结果为阴性，而同一样品的 直接检测结果却为阳性。这种差异不能简单归咎于假阴性。因为 本次实验采用的TYCSB培养基属于选择性培养基，它是基于变链 菌对杆菌肤相对的抵抗性设计的，寻找对非目标菌最大抑制与变 链菌最佳生长的平衡点。iideSoet在其实验中发现了在TYCSB 上受到抑制不生长的远缘链球菌(杆菌肤敏感株)