RKCα和PKCδ在不同发育阶段小鼠睾丸中的差异性表达.pdfVIP

中文 摘 要 前 言 蛋白激酶C(PKC)是广泛分布于真核细胞，特别是哺乳动物 细胞中的一种Cat/磷脂依赖性的蛋白激酶。它广泛参与细胞信 息传递、分泌、离子通道调节、细胞增殖、分化及癌变等一系列与生 一 命现象相关的过程。因此，有关PKC的研究已成为生物化学和分 子生物学十分活跃的领域之一。 、、\厂PKC是一个具有多种亚型的大家族，目前已发现有12种同工 酶，七们在组织分布、激活剂、蛋白质及基因结构上均存在差异。 在不同的外界刺激下，不同的PKC亚型可被选择性激活，被激活 的不同PKC亚型转位到不同的亚细胞区域，可产生不同的生物效 应;而且，不同生物、不同组织来源的细胞具有不同的PKC亚型， 对不同的外界刺激的反应也不相同。目前各种PKC亚型的准确 的生理作用仍不清楚，但它们在功能方面的差异可能会反映在蛋 白及基因的表达和定位上。 PKC同工酶广泛的分布于哺乳动物各组织、细胞中。目前已 证实在哺乳动物皋丸中也有PKC同工酶的存在。哺乳动物皋丸 组织是产生精子及分泌雄性激素的器官。在进入性成熟期以后， 辜丸生精上皮中的原始生精细胞，即精原细胞开始进行减数分裂， 一步步发育、分化，形成成熟的精子。因此辜丸的年龄性变化主要 是精子发生及形成过程的变化。我们用发育过程中不同周龄的小 白鼠辜丸组织，研究不同的PKC同工酶在蛋白及基因水平上的表 达情况，从而进一步探讨PKC同工酶在辜丸发育过程即精子发生 及形成过程中的作用。 ·1· 实验材料与方法 本实验运用免疫组化、Western印迹杂交及RT一PCR等方法 检测了出生后1周龄、2周龄、3周龄、5周龄、8周龄、12周龄雄性 昆明系小白鼠皋丸组织中PKC-a和PKC-8的表达。 1.Western印迹杂交:用PKC一a和PKC一8特异性抗体检测 各周龄小鼠辜丸组织蛋白提取液中PKC一。和PKC一8蛋白表达 数量。 2.免疫组织化学检测:各周龄小鼠翠丸组织常规固定，石蜡包 埋，切片，用兔抗鼠PKC一a和PKC一8的特异性抗体和过氧化氢 酶标记的链酶卵白素(SP)染色试剂盒检测PKC一a和PKC一8的 蛋白表达阳性细胞。 3.RT一PCR半定量测定:用TRIzol总RNA提取试剂提取皋 丸组织总RNA，反转录合成，DNA第一链，分别扩增PKC一a,PKC 一8的PCR产物，检测两者mRNA相对含量。 4.统计分析:运用单因素方差分析判断是否各组总体均数全 部相等;各组均数间两两比较运用LSD方法。 实 验 结 果 1.Western印迹杂交结果:各周龄样品均可见PKC一a的表 达，且扫描灰度值基本一致;生后1周龄,2周龄拿丸样品中PKC 一8蛋白几乎无表达，第三周开始出现微弱表达，以后随周龄增加 扫描灰度值逐渐增加。 2.免疫组化结果:各周龄小鼠的皋丸中均可见到PKC一a的 表达且分布广泛，各组间无差异(P0.05);生后两周小鼠辜丸中 无PKC一S的表达，第三周开始在管腔侧出现少量阳性细胞，第五 ·2 · 周明显增加，直到第八周EJ}丸发育成熟，各组间比较存在明显差异 (P0.001)。 3.PKC一a及PKC一8mRNA半定量测定结果:各周龄辜丸样 品中均有PKC一a的基因表达，且含量差别不大(P0.05);PKC 一8在生后第一周、第二周皋丸中未见mRNA表达;第三周表达微 弱，以后逐渐增加，各组间差异明显(P0.001)o 讨 论 在精子形成这样一个独特的细胞分化过程中，PKC的生理功 能仍未十分明确，