中国美利奴绵羊453O11 BAC克隆片段序列组成与结构分析.pdf

中国美利奴绵羊453O11BAC 克隆片段序列组成与结构分析 摘 要 本研究以中国美利奴绵羊453O11 BAC 克隆片段序列为研究对象，采用噬菌斑原位杂交的方法 从cDNA 文库中筛选表达序列，对中国美利奴绵羊453O11 BAC 克隆片段序列的组成与结构进行分 析, 为以后探索绵羊MHC class I 区段的基因与绵羊疾病相关性，筛选优良的绵羊品种，研制有效的 疫苗提供理论依据。 采用基因预测与PCR 相结合的方法，从绵羊cDNA 文库中获得表达基因。通过使用真核生物软 件Genscan 1.0 （http://CCR-081./ GENESCAN.html ）和Fgenesh 软件对453O11 BAC 克隆片段 序列进行基因预测，获得了 15 个基因的 CDs 序列和蛋白质序列。将预测得到的蛋白质序列与 GeneBank 上的Nr 库进行Blastp 比对，从而得到各个基因的蛋白序列相关的基因注释。以获得的CDs 区序列为模板设计了四对引物Cxxy10、Cxxy11、Cxxy13 和Cxxy15 ，采用PCR 的方法从cDNA 文 库中扩增表达基因。四对引物中，有Cxxy10、Cxxy13 和Cxxy15 三对引物成功的从绵羊cDNA 文库 中扩增得到了表达基因。将扩增序列测序，测序结果与453O11 克隆片段进行比对。结果显示，C10 基因与453O11 克隆序列相似性达到了94.7%，C13 基因的相似性为97.3%，C15 基因的相似性达到 了99.2% 。这就说明在该克隆上的确存在这三个基因。由此可知，采用基因预测与PCR 相结合的方 法，可以快速高效的从cDNA 文库中获得表达基因。 通过基因预测与PCR 相结合的方法获得的表达序列片段过短，不利于基因功能的研究。所以， 为了获得基因的全序列，本研究采用了噬菌斑原位杂交的方法从cDNA 文库中筛选出相应基因的原 克隆。以三个基因的PCR 产物制备探针，进行噬菌斑原位杂交，3 个基因都筛选到了阳性克隆。将 筛选的阳性克隆测序，测序结果采用MegAlign 软件与453O11 克隆进行比对。比对结果显示，C10 基因含有2 个外显子，C13 和C15 基因分别含有3 个外显子。将8 个外显子在453O11 克隆序列上 进行定位，发现C13 基因和C15 基因存在外显子选择性剪接。因此，通过噬菌斑原位杂交的方法可 以获得表达基因的全序列，这为后续进行基因功能的研究提供了基础。 将测序结果与GeneBank 上的数据库进行核苷酸序列比对，比对结果显示C10 基因和C13 都与 牛的朊蛋白基因和类朊蛋白基因以及牛的ABCG2 基因、PKD2 基因和SPP1 基因具有很高的相似性， 这就表明C10 基因和C13 基因可能与某些绵羊疾病的易感性相关。C15 基因与牛的反转录酶基因有 很高的相似性，表明C15 基因可能与一些与反转录相关的疾病有关。因此，对这三个基因功能的研 究将有助于对家畜致病机理的进一步了解，对家畜疾病防御有重要意义。 将三个基因与GeneBank 上的SNPs 数据库进行比对，发现C10 基因存在多态性。设计引物，对 11 种绵羊品种的基因组DNA 进行C10 基因的体外扩增，将扩增序列测序，进行多重比对。比对结 果显示，C10 基因在该片段序列上存在着丰富的多态性。这丰富的多态性，为后面基因功能的差异 性研究提供了基础。 关键词：cDNA 文库；基因预测；BAC 文库；PCR I 中国美利奴绵羊453O11BAC 克隆片段序列组成与结构分析 Abstract The essay chose the 453O11 of China Merino BAC Clone as the study boject.Obtained the expressed genes from the cDNA library of China Merino by making bacteriophage hybridization, then analysised on the gene component and construction of