米根霉发酵产L乳酸途径丙酮酸分支点调控机理研究.pdf

米根霉发酵产L-乳酸途径丙酮酸分支点调节规律研究 摘 要 米根霉发酵产 L-乳酸途径中，由于丙酮酸分支点存在丙酮酸脱氢酶（PDH ）、丙 酮酸脱羧酶（PDC ）和丙酮酸羧化酶（PC ）对丙酮酸的载流分流，降低了 L-乳酸的 转化率，产生多种副产物。所以对丙酮酸分支点进行碳代谢流分配及调控机理研究， 以提高目标产物转化率，降低副产物流量，具有重要的理论和实际意义。本文通过研 究不同通气条件下米根霉 As3.2686 发酵罐过程中生产有机酸情况及丙酮酸分支点的 酶活性水平，建立代谢通量分析方程式，并计算不同通气条件下代谢流的分布情况， 进而通过研究丙酮酸分支酶活性以及代谢通量之间的关系，计算程度控制系数（Cpi） 和通量控制系数（FCC ），以寻找对米根霉代谢产 L-乳酸发酵系统调控能力最强的分 支酶。主要研究结论如下： （1）以通气量作为扰动代谢平衡的手段，研究米根霉As3.2686在发酵罐中 通气条件分别是0.5 L/(L·min) 、1.0 L/(L·min) 、1.5 L/(L·min) 、2.0 L/(L·min) 、 2.5L/(L·min)时菌丝体的生物量和比生长速率，总酸生产量和比生成速率，以及四种 主要碳代谢产物（L-乳酸、苹果酸、乙醇、富马酸）的产量。结果表明L-乳酸产量在 通气量为1.5L/(L·min)和2.0L/(L·min)较大，分别达到39.59g/L和34.60g/L 。苹果酸、乙 醇、富马酸则分别在0.5 L/(L·min)、2.0 L/(L·min)和2.0 L/(L·min)时具有最大生成量， 产量分别为6.02g/L、2.05g/L和0.37g/L 。 （2 ）在测定代谢产物组成基础上，构建代谢网络模型和代谢平衡方程，并 结合细胞组分建立胞内反应的计量学模型，计算获得不同通气条件下代谢网络 的代谢流分布图，以及丙酮酸分支点不同分流途径的流量分配比。结果表明，在 该发酵系统中，葡萄糖- 丙酮酸转化率随通气量增大先增加后减小，通气量为 2.0L/(L·min)时最高，达到92.77% 。L-乳酸通量分配比在通气量为2.0L/(L·min)时最高， 为60.00%，高于通气量为1.5 L/(L·min)时的53.11% 。草酰乙酸、乙醇、乙酰辅酶A 途径负担的通量分配比最大通气量分别是2.5 L/(L·min)、1.0L/(L·min) 、0.5 L/(L·min)， 此时分配比分别为30.01%、52.07%和4.20% 。 （3 ）通过代谢控制分析，比较PDH 、PDC 、PC 、LDH （乳酸脱氢酶）和ADH （乙 醇脱氢酶）在不同通气条件下的活性变化情况，发现PDH酶活性在0.5L/(L·min)时最低， 在2.0 L/(L·min) 时较高，在发酵24 ～60h期间均超过12U/L 。乙酰辅酶A 通量在0.5 L/(L·min)时流量分配比最大；PDC酶活性在2.0L/(L·min)时酶活性非常低，而此时乙醇 实际产量最高，与酶活性变化趋势相反；PC酶活性总体上在0.5L/(L·min)时非常低， 此时富马酸产量较低，而苹果酸实际产量很高；LDH酶活性变化趋势与L-乳酸实际产 量较为吻合，通气量为2.0 L/(L·min)时LDH酶活性和L-乳酸途径通量分配比都是最高， 但L-乳酸实际产量却比通气量1.5 L/(L·min)时略低，说明2.0L/(L·min)时存在其它因素 限制L-乳酸转化。ADH酶活性变化趋势与乙醇产量变化曲线吻合，2.0 L/(L·min)时酶 活性最大，产量也最高，但此时乙醇途径流量分配比低于1.0 L/(L·min)时，说明低通 气量抑制ADH 乙醇转化反应。 （4 ）由相关性分析和程度控制系数的计算可知，PC 与PDH 、LDH 与PDC 、ADH 与PDC 、LDH 之间均呈显著相关性（P0.01 ），PDC 对丙酮酸稳态通量起负控制作用。 对L-乳酸通量，正控制程度依次是PDH 、PC 和LDH ，ADH 呈负控制；对乙醇通量， PDH 和ADH 的控制作用最强，PC 起强负控制作用；对乙酰辅酶A 通量， PDH 和 PC 起主要正控制作用；对草酰乙酸通量， PDH 和PC 的控制作用最强，ADH 的负 控制能力也很强。 （5 ）拟合稳态通量与丙酮酸分支酶酶活性的曲线，计算丙酮酸分支酶对系统的 FCCs 值可知，对于代谢稳定期来说，主要施加控制能力的是 PDC 和