电脉冲精子介导转基因与转pCAhLFc草鱼抗出血病的研究.pdfVIP

电脉冲一精子介导转基因法和 转pCAhLFc草鱼对GCHV抗性的研究 钟家玉 摘要 本文共五章，包括以下主要研究内容:用稀有鲍鲡和草鱼发展和优化一种简 便易行的转基因方法，即电脉冲一精子介导转基因法;研制转人类乳铁蛋白基因草 鱼，并在其鱼种阶段检测其抗病力;以稀有驹螂为实验材料，进一步研究电脉冲 一精子介导转基因法的机制。 陈一章:综述近年在鱼类转基因方法上的研究进展，各种转基因方法的优势 与不足，人类乳铁蛋白hLF的生理功能的研究进展，草鱼出血病的研究现状。 第二章:重组质粒pCAhLFc的构建，将我国鲤科 “全鱼”重组质粒，即草鱼 生长激素。DNA与鲤鱼的p一肌动蛋白基因启动子的重组体 (pCAgcGHc)的启动 子部分pCA和人类乳铁蛋白cDNA(hLFc)连接起来，构建为重组质粒pCAhLFco 第三章:以稀有驹螂为实验材料，优化电脉冲一精子介导转基因法的参数，并 对这种方法的机制进行探讨。将稀有约纫精子与重组质粒pCAhLF。线性DNA混 和温育，经不同条件的电脉冲处理后，与卵子受精，孵化出苗，PCR检测，结果 表明25.5%一“.7%鱼苗带有外源基因。用显微镜观察精子的活力并统计受精率， 发现不同的电脉冲条件对精子有不同的损害作用。用DNA外切酶消化电脉冲处 理过的精子，证明电脉冲可以促使精子摄入外源基因。与显微注射相比较，在卵 子质量不高的条件下，电脉冲一精子介导转基因法获得较高的出苗率。 第四章:通过电脉冲一精子介导转基因获得转pCAhLFc草鱼，并设置不同的 电脉冲参数组合对这种方法进行优化。将草鱼梢子与重组质粒pCAhLFc线性 DNA混和，经电脉冲处理，与卵子受精，得到若千草鱼苗。将草鱼苗匀浆，进行 PCR检测，结果表明19.6-46.9%的鱼苗带有外源基因。本实验获得的最佳实验参 数是:外源基因在精液中的浓度为2!)Ong/pl，电脉冲参数设置为lOkV.12x4个 循环、21。脉冲/循环、0.4sec，此时鱼苗的阳性率可高达46.8%. 中文摘要 第五章:用草鱼出血病病毒GCHV对5月龄的转pCAhLFc草鱼和对照组草 鱼进行攻击性毒性实验，发现5月龄的转pCAhLFc草鱼抵抗GCHV的能力比对 照鱼高。 本文通过对上述问题的研究，发展了一种更简单快捷易行的转基因方法，并 探讨了这种方法的机制:探索了转pCAhLFc增强草鱼抗出血病病毒能力的可行 性，为从另一个角度培养抗GCHV草鱼品系打下了基础。 有待进一步研究的问题包括:①用电脉冲一精子转基因法转入的外源基因的行 为 (如复制、整合和遗传等)和别的途径 (如显微注射法)的有无差别;②hLFe 在草鱼体内的表达量和抗GCHV能力的相关性;③将电脉冲一精子转基因法和基 因定点整合技术结合起来研制抗病转基因草鱼品系的培育 的培育。沙、， 关键词:鱼，转基因，电脉沁精子，稀有鲍0人类乳铁蛋白二草鱼出血病J GCHV，攻毒 Electroporated-sperm-mediatedgenetransferand resistanceofpCAhLFctransferredrgasscarptoGCHV ZhongJiayu Directedby:Prof.ZhuZuoyan,AcademicianofCAS InstituteofHydrobiology,ChineseAcademyofSciences,Wuhan,430072 ABSTRACT This5-chapterofdissertationismainlyonthreetopicsofresearchwork.Thefirst oneistodevelopandoptimizeonemethodofgenetransferandmakeitpracticableon gras