多倍体鲫鲤Piwi和piRNA表达与育性相关性研究.pdf

。．＼＼，、；、．、，，、、，＼ 中文摘要 redvat．，2n=100) auratus 利用染色体数目相同的红鲫(Carassius L．，2n=100)为父本产生的属间 为母本，湘江野鲤(Cyprinuscarpio 杂交后代中，获得了两性可育的异源四倍体鲫鲤(Fs)。在异源四倍 体鲫鲤稳定产生二倍体配子的基础上，利用异源四倍体鲫鲤(4nAT) 与相关二倍体鱼等进行倍间交配，获得了生长速度快、抗病力强具有 明显养殖优势的三倍体鱼。四倍体、三倍体鱼的形成为不同倍性鱼的 生物学比较提供了重要的生物学平台。Piwi基因和piRNA在控制动 物性腺发育中起重要作用。通过不同倍性鱼Piwi基因和piRNA的比 较研究，探讨了三倍体湘云鲫、二倍体红鲫和异源四倍体鲫鲤 Piwi-piRNA信号通路的相同性和差异性。此外，鱼类性腺发育主要 axis)为主的神经内分泌系统所调控。 受下丘脑．垂体．性腺轴(HPG 而三倍体湘云鲫的HPG轴表达紊乱，因此有必要将HPG轴对该信号 通路的调控作用做深入研究。本研究为进一步了解三倍体湘云鲫的不 育性和异源四倍体鲫鲤可育性的分子内分泌机制提供理论依据，同时 也为探讨Piwi．piRNA在硬骨鱼类中对鱼类性腺发育和配子发生的分 子机制提供参考。 本研究首次比较分析了二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤 Piwi基因及piRNA的表达差异，并研究了HPG轴相关激素对其的影 响。主要内容如下： 1．二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤Piwi基因cDNA的 I 全序列克隆，包括Piwil．1和Piwil．2基因。系统进化树中所有的Piwi 长序列所包含的开放阅读框翻译的蛋白都含有PAZ和PIWI两个典型 的Piwi基因功能域。另外，在鱼类中仅仅发现有2个Piwi旁系同源 基因，而在两栖类或者哺乳类中的3到4个Piwi基因。这可能与高 等动物中复杂的功能调控有关。 2．比较研究Piwi基因在不同倍性鲫鲤不同组织中的表达情况。 Piwi基因在三种鱼中仅在精巢和卵巢中有表达，而在其它进行检测的 在精巢中的表达量在繁殖季节低于二倍体红鲫和异源四倍体鲫鲤。对 在繁殖均显著高于二倍体红鲫和异源四倍体鲫鲤。免疫组织化学的结 果显示，Piwil．1和Piwil．2蛋白表达于早期的卵母细胞、滤泡细胞和 颗粒细胞，另外在较成熟的卵细胞放射膜周边也有表达。 3．HPG轴对Piwi—piRNA信号通路的调控。体内和体外实验均证 对Piwi的表达有抑制作用。与此类似，体内和体外E2处理实验证明， E2对piwil一1和Piwil一2基因表达有抑制作用。同时，在繁殖期，三 倍体湘云鲫卵巢中LHR的表达量明显低于二倍体红鲫和异源四倍体 鲫鲤。由此，可知三倍湘云鲫的LHR表达较其它鱼低，HPG信号通 路不能正常表达，从而导致了下游的E2表达较低。因此，在繁殖季 节，三倍体湘云鲫较低的E2不能正常抑制Piwi基因的表达，Piwi 在三倍体湘云鲫中就表达异常，明显高于其它两种可育鱼类。 4．通过克隆卵巢中的小RNA序列在二倍体红鲫中获得了61个 piRNA，三倍体湘云鲫中获得了72个piRNA，异源四倍体鲫鲤中获 并结合本研究室前期的红鲫和鲤鱼的肝脏转录组测序结果，构建了数 据库，对克隆的piRNA序列进行来源分析。结果显示仅有12个piRNA 比对到mRNA序列，但是比对到的基因功能广泛。例如，ikbkg基因 在免疫功能里有重要作用，zp2．5是与卵子发育密切相关的基因，ttlll0 是一种微管蛋白络氨酸连接酶，ttnb是肌肉纤维的组成部分，锌指蛋 白zbtb48是转录因子。可以看出，这些基因功能广泛，在生命活动 中有重要意义。 5．不同倍性鲫鲤piRNA的表达差异分析及E2对其调控作用。7 个piRNA中有5个在三倍体湘云鲫中其表达显著性高于二倍体红鲫 和异源四倍体鲫鲤。这些结果证实，piRNA的表达量与Piwi基因的 表达有一定的联系。piRNA的表达量也受ItPG轴的终端因子E2的 抑制。 综上