人喉癌细胞Hep2线粒体DNA缺失模型建立及放射生物学观察.pdfVIP

·175· ·物理·生物·技术· 人喉癌细胞Hep2线粒体DNA缺失模型建立及放射生物学观察 徐会周福祥何为 江换钢胡柳谢丛华周云峰 放疗主要机制是放射线直接或间接造成细胞DNA损 射，一组不照射，按说明书进行操作，根据标准曲线计算ATP 伤，而线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)比核DNA浓度。 (nuclearDNA)缺少组蛋白保护，位于氧化呼吸链附近，更易 7．ROS测定：采用ROS检测试剂盒，按说明书操作。4 受到损伤且损伤后缺乏有效修复¨o。笔者通过构建Hep： min取出检测1次 Gy照射完立即检测荧光值记为ft。，每30 mtDNA缺失的Po细胞模型，观察其放射敏感性、增殖、周期、荧光，荧光增长率为(ft。一fro)／fro×100％。 PadPrism ATP及活性氧族(reactivespecies，ROS)变化，探讨 5．0软件拟合多靶单 oxygen 8．统计方法：使用Graph mtDNA与放射敏感性的关系及可能机制。 击模型细胞存活曲线。采用SPSS18．0软件对计量资料行 一、材料与方法 独立样本t检验，PO．05为差异有统计学意义。 1．主要试剂：DMEM培养基、胰酶、胎牛血清、溴化乙锭、 二、结果 丙酮酸钠、尿苷、CCK。细胞DNA提取试剂盒、细胞周期试剂 1．Po细胞的鉴定：当培养液中缺少丙酮酸钠及尿苷时， 盒、ROS及ATP检测试剂盒。 ns／ml溴化乙锭、 2．Po细胞模型构建：Hep：细胞在含50 条带缺失，nDNA条带未受影响(图2)。 110mg／L丙酮酸钠及50¨g／rIll尿苷的10％胎牛血清高糖 50 DMEM培养液中进行培养，有限稀释法获得Po细胞(Hep： 40 细胞培养基仅不含50ng／ml溴化乙锭，其余成分均与Po细 胞培养基相同)。 30 3．Po细胞鉴定：(1)生长缺陷鉴定：分别用含或不含丙 20 酮酸钠及尿苷的胎牛血清高糖DMEM培养液培养Po细胞， 一气一姆世米螫 1 0 d。用分 CCK。细胞DNA提取试剂盒检测细胞增殖，连续6 光光度仪测量450nln处的吸光度值(A)。(2)PCR：mtDNAo l 2 3 4 5 6 天数 特异性的COX-I和mtDNA-P。引物和nDNA特异性的B- actin引物：COX．IF：5’一ACACGAGCATA7兀TCACCTCCG-3’，图1 p”细胞线粒体DNA缺失对Hep2细胞生长曲线的影响 COX—IR：5-GGA唧GGCGTAGGl[fIfrGGTC-3’，337bp； F：5-AACATA mtDNA-P1 CCCATGGCCAACCT·3’，mtDNA- PlR：5-GGCAGGAGTAATCAGAGGTG-3’，533bp。p-actin R： 5’一 F： 5-7IGGAAGGAC7I℃ATGACCACA一3’，