生物大分子荧光探针的研究及应用.pdfVIP

摘 要 摘 要 本文重点对红区荧光染料竹红菌素和酚藏花红作为脱氧核糖核酸荧光探针进行了研 究，并对9，lo一蒽醌一2，6．二磺酸钠作为蛋白质研究的光化学荧光探针作了探索性的研究。 全文共分为三章。 第一章，光化学荧光分析法和核酸探针研究的进展。 在这一章里，本文通过大量的文献调研，较全面的综述了光化学荧光分析法和核酸探 针研究进展。首先介绍了光化学荧光分析法的原理，特点及实验技术，及其在光衍生化反 应、模拟酶研究、催化光化学荧光反应和生物大分子光化学反应标记等方面的应用，并列 表给出了部分应用实例。其次介绍了核酸探针技术的研究进展，从核酸探针技术的基本原 理入手，介绍了放射性同位素标记和非放射性标记，并对非放射性标记中酶标记，半抗原 标记和化学发光标记进行了综述，尤其对荧光核酸探针的国内外研究状况和进展进行了较 详细的综述。最后在此基础上提出r本论文的设想。 第二章讨论了红区发射的核酸荧光探针的可行性及应用。在这一章里，本文研究了红 用HA和Ps表征生物大分子的可行性及性质特征，为开发应用新的红区荧光探针，研究小 分子与生物大分子的作用提供了有用的信息。 在红区发荧光的天然物质少，这使得在进行诸如组织、血清、尿液等复杂生物样品的 测定时，可以有效地避免生物样品背景荧光的干扰；散射光强度与r成反比关系，因而可 以极大的降低散射光的干扰。因此红区荧光探针的应用，可以避免背景荧光和散射光的干 扰，使检测限得到较大的改善，有利于进行复杂样品中生物大分子的测定。 此章分为两部分： 第一部分研究了红区荧光染料竹红菌素(HA)作为核酸荧光探针的可能性与可行 性。我们首先通过HA与DNA结合体系的吸收光谱、荧光特性、盐效应以及碘猝灭效应 强的亲合能力，HA与DNA结合后荧光光谱和吸收光谱的形状及谱峰位置均没有发生变 化。盐效应结果表明，NaCI的加入使HA．DNA体系的荧光猝灭，这说明NaCI的加入可 II 生物大分子荧光探针的研究及应用 以有效地使结合的HA从DNA中释放出来，从而使HA的荧光量子产率降低而猝灭体系 的荧光。而碘猝灭效应结果表明碘离子是有效的猝灭剂，在DNA存在的情况下，KI对 体系荧光的猝灭程度加大。这些现象表明HA是以非嵌入方式与DNA结合的。 随后我们以HA为探针，优化了反应条件，建立了DNA与RNA的新的荧光测定方 法．结果表明HA与DNA结合后，HA的荧光量子产率大大提高，并且体系相对荧光强 度的增加程度与加入的DNA量呈良好的相关性。在此基础上我们建立了核酸的灵敏测定 方法。对T-DNA的测定来讲，20％的RNA不干扰测定。 第二部分重点研究了红区发射的荧光染料酚藏花红(PS)与DNA的作用方式。我 们通过Ps与DNA结合体系的荧光光谱、吸收光谱、及偏振实验，证实了Ps的确结合到 DNA大分子上。随后，应用对照实验，表明Ps不与胸腺嘧啶和三磷酸腺苷二钠反应，排 除了PS与DNA以静电吸引方式结合的可能性。通过碘猝灭实验，发现PS与DNA结合 后，KI对其荧光猝灭程度明显减小，证明了PS以嵌入方式与DNA结合。盐效应实验结 果表明，NaC]的加入不利于PS与DNA的结合反应，这是由于DNA在高盐浓度介质中， 双链团得较紧，使PS不易嵌入其双链，而易于被捧斥游离于溶液中，导致荧光强度回升。 我们还考察了温度的影响．发现热变性后的DNA与Ps的亲合力降低。溴化乙锭(EB)及 吖啶黄(AY)的竞争实验结果表明EB及AY的加入均使PS—DNA体系的荧光强度回升，这 公认的嵌入剂，这进一步证明了PS是以嵌入作用方式与DNA结合的。 根据上述研究，在优化实验条件的基础上，我们建立了PS荧光猝灭法测定核酸的新 方法。PS与DNA结合后，荧光量子产率大大降低，并且体系相对荧光强度的降低程度 与加入的DNA量呈良好的相关性。在此基础上我们建立了核酸的灵敏测定方法。对DNA 和RNA混合样品的测定结果表明，Ps对DNA的灵敏度明显比RNA高．对于DNA的 测定来讲，10倍量的RNA不干扰测定。 第三章我们探索了光化学荧光探针在蛋白质研究中的应用。 在这一章里，我们用9，10．蒽醌-2，6-二磺酸钠(AQDS)作为外源光化学荧光探针来标 性，探索了光化学荧光分析(PCF)技术在蛋白质性质研究中的可能性与可行性。这一部 分工作，由于可籍借的参考文献少，尚属探索性研究，难度较大，极具挑战