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红松体细胞胚胎发生和超低温保存技术研究** 摘 要 本研究以红松(Pinus koraiensis sieb. et zucc.) 未成熟合子胚为外植 体，诱导体细胞胚胎发生，研究了红松体细胞胚胎发生的各种影响因素、 胚性愈伤组织在体细胞胚胎诱导过程中的生理生化特性以及愈伤组织的 超低温保存，具体结果如下： 1、分别于 7 月 5 日、7 月 15 日、7 月 25 日采收红松未成熟合子胚， 在添加 2,4-D 1.0 、2.0 、4.0mg/L ，6-BA 0.5、1.0、2.0mg/L GLH 诱导培养 基上诱导愈伤组织。结果表明：未成熟合子胚的采样时间(发育程度) 、 2,4-D 和 6-BA 的浓度极显著影响红松愈伤组织的诱导率。多重比较可知 7 月5 日前后为红松未成熟合子胚的最佳采样时期，2,4-D 2.0mg/L ＋6-BA 1.0mg/L 为诱导红松愈伤组织的最佳生长调节剂浓度组合，最高诱导率达 43.33% 。 2 、红松胚性愈伤组织增殖阶段的生长曲线基本呈“S”形，继代 20d 后胚性愈伤组织增长趋于停滞。胚性愈伤组织生长率先快后慢，生长率 最大值出现在继代后第 12d 左右。研究结果表明了红松胚性愈伤组织增 殖培养阶段适宜的继代频率为每 2-3 周继代一次。 3、分别在 GLH 培养基上添加不同浓度的蔗糖、ABA 、PEG 来诱导 红松体细胞胚，结果表明不同浓度的蔗糖、ABA 对红松体细胞胚胎的诱 导有极显著影响，GLH ＋蔗糖 60g/L＋ABA 20mg/L 为诱导红松体细胞胚 胎的最佳培养基，体细胞胚诱导数量达到 47.5 个/克愈伤组织，但 PEG 对红松体细胞胚的诱导并没有显著影响。诱导所得体细胞胚在萌发培养 基(GLH ＋蔗糖20g/L)上萌发率为 73.3% 。萌发后生成的体胚苗移栽成活 率为 64.3% 。 4 、成熟胚诱导阶段红松胚性愈伤组织内可溶性总糖与蔗糖含量变化 趋势相似，两者都是 0-5d 迅速上升，5-15d 下降，15-25d 再上升，之后 保持平稳。可溶性蛋白质含量在 0-10d 升高，10-20d 降低，20d 后又上升 并有分子量大小约为 63.2 和 31.7KD 两种特异蛋白出现，这些特异蛋白 可能作为体细胞胚胎形成的调控因子或结构蛋白而起作用。糖分与蛋白 含量在此阶段均出现先上升、后下降再上升的变化趋势，这这表明此阶 段胚性愈伤组织内代谢旺盛，体细胞胚胎正在形成。 5、红松愈伤组织分别预处理 0、12、24 、36、48h 后用 6 种不同的 冷冻保护剂进行超低温保存，保存 3d 后用 4 种不同方法解冻，结果表明： 利用 0.4mol/L 山梨醇(Sorb)溶液将红松愈伤组织预处理 24h ，以 5% DMSO ＋Sorb 0.4mol/L 为冷冻保护剂进行超低温保存，采用 20 ℃流水冲 洗解冻，细胞的存活率较高，经恢复培养存活率达 64.4 ％，这一研究结 果为红松愈伤组织中长期保存技术的研究奠定了基础。 关键词：红松，体细胞胚胎发生，生理生化特性，超低温保存 ** 本项研究受国家自然基金项目（NO）资助。 SOMATIC EMBRYOGENESIS AND CRYOPRESERVATION OF PINUS KORAIENSIS SIEB. ET ZUCC. ABSTRACT In this thesis, immature zygotic embryos of Pinus koraiensis Sieb. et Zucc. were used as the initial explants for somatic embryogenesis. The factors affecting somatic embryogenesis, physiological and biochemical characteristics of embryogenic callus as well as the callus cryopreservation were investigate