OmpA信号肽介导重组大肠杆菌生产α环糊精葡萄糖基转移酶发酵优化.pdf

摘 要 环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶，EC2．4．1．19)是糖基水解酶洳淀粉酶家族(家 族13)的重要成员，它能通过环化反应将淀粉转化为环糊精(简称CD)。根据CGT 酶反应起始阶段生成环糊精的主要类型，将CGT酶分为a．、D．和丫．CGT酶。随着q．环 糊精在食品、分子识别和纳米材料等领域的广泛应用，0【．CGT酶已成为当今研究的热点。 coliBL21 本论文以所在实验室构建并保存的含分泌型信号肽OmpA的大肠杆菌E 度为目标，在摇瓶和3L发酵罐中研究了发酵培养基和培养条件对仅．CGT酶的胞外分泌 的影响。本论文主要研究内容如下： l、重组大肠杆菌在种子培养基中的最佳活化时间为6．8h。在摇瓶水平下，在菌体 生长的对数前期添加O．75％(w／v)甘氨酸能有效地提高a．CGT酶的胞外产量，当发酵 至36h时，胞外酶活达18．9U／mL，是同期不添加甘氨酸的2．2倍。在摇瓶水平下，通 过一系列单因素实验优化出的发酵培养基组成为：甘油10 g／L，工业级蛋白胨18g／L， 工业级酵母粉20 16．43 2．31 5mM，初始 g／L，KEHP04·3H20g／L，KH2P04g／L，MgCl2 在摇瓶条件下重组大肠杆菌胞外生产0【．CGT酶的能力从发酵60h的20．5U／mL提高到发 U／L／ll。 酵48h的56．0U／mL，生产强度从341．7U／L／h提高到1166．7 2、采用优化后的复合培养基研究3L罐分批发酵的溶氧及分批．补料发酵中的诱导 剂对重组大肠杆菌发酵生产0【．CGT酶的影响，结果显示分批发酵中的大肠杆菌在 30％DO下所得的胞外酶活最高，达到17．8U／mL，分别为同期20％DO和40％DO水平 下的1．7和1．2倍。分批．补料发酵中的大肠杆菌在诱导条件下的产酶状况比非诱导条件 下好，其中采用IPTG诱导时，发酵30h的胞外酶活达49．7U／mL，是非诱导条件下的 1．6倍；采用乳糖诱导时，发酵27h的胞外酶活达44．0U／mL，是非诱导条件下的1．4倍。 3、在3L罐中研究非诱导条件下合成培养基对重组大肠杆菌高密度发酵生产a．CGT 酶的影响，结果显示合成培养基适合菌体的高密度生长，菌体OD600最高达到150．0， 但菌体不产酶。为了诱导重组大肠杆菌表达异源蛋白，实验比较了不同诱导剂、诱导浓 mM IPTG 度和诱导时间对菌体高密度发酵生产a．CGT酶的影响，结果表明：1)在O．5 诱导下，菌体在诱导后1h立即开始自溶，胞外无酶活；在8．0 g／L／h乳糖诱导下，菌体 U／mL。 在诱导后4h内继续以指数形式增长，菌体OD600最高为71．1，胞外酶活最高达lO．0 2)菌体在0．8 U／mL， g／L／h乳糖诱导下的胞外酶活最高，发酵27h的胞外产量达46．44 分别是0．4 eCL／h和8．0 的胞外酶活最高，分别为OD600=25和100诱导的5．5倍和66．3倍。 4、在3L罐中研究补料液中的氮源以及诱导温度对重组大肠杆菌高密度发酵生产 a．CGT酶的影响。结果显示：1)菌体在含有机氮源的补料液中发酵所得胞外酶活最高， 为105．1U／mL，是对照实验的2．3倍；在含无机氮源的补料液中发酵所得胞外酶活最低， 为8．8 摘要 导下5．1倍和3．6倍，该产量是目前所有报道胞 萄糖基转移酶，胞外生产，