胸腺γδT细胞分化去向.pdf

·中文论著摘要· 胸腺丫6T细胞的分化去向 —‘‘-—量 刖 声 多能淋巴干细胞迁移至胸腺，从胸腺的皮质逐渐移行到髓质，经过阳性选择和 cell 阴性选择，逐步分化成熟为T细胞。T细胞表面的抗原受体(Treceptor)TCR 有两类，一类是由q链和13链组成的TCR0t13，另一类是由Y链和6链组成的TCRra。 迄今为止，关于TCR76细胞分化成熟的过程以及生理功能、识别抗原的特点等方 面还所知不多，远没有TCRal3细胞那样详尽。78T细胞主要分布于皮肤和粘膜组织， 数量较少，但它在抵御外界病原体侵害、免疫调节和肿瘤免疫等诸多方面都有着 不可替代的作用。因此，T6T细胞也引起了众多学者的关注。近几年的研究表明： 丫6T细胞以胸腺内和胸腺外两条途径发育。胸腺内发育的依据是应用骨髓干细胞在 M等人在2007年的研究中发现大 胸腺组织内培养可以诱导分化为34iT细胞。Ciofani 量的胸腺衍生信号和高度保守的分化途径，促使T细胞逐步分化成熟。T细胞的发 育是以级联方式有序发生的，TCR基因的启动顺序依次为TCRD(6)．TCRG(月r) 免疫应答和适应性免疫应答的中间过渡阶段。过渡性免疫应答理论认为部分胸腺 C57BL／6胎鼠为研究对象，采用胚胎 raT细胞可分化为QBT细胞。我们以胎龄14．5d 胸腺器官培养(FTOC)、CFSE染色及流式细胞分选和检测等技术来观察胸腺245T 细胞的分化去向，为过渡性免疫应答提供科学的理论依据。 实验材料 一、主要试剂 TCR7： Red- IgG和TexaRed-抗TCRr二抗；羊抗鼠的～抗SC-9101TCR{I：IgG和Texa 养液II：20％成鼠血清RPMll640(除血清不同外，两种培养液其他成分相同)等。 二、主要仪器 体视显微镜；流式细胞仪；荧光显微镜；显微外科镊、剪；C02恒温培养箱； 倒置显微镜；台式离心机；小离心机；超净空气净化台；酶标仪；超声波细胞破 碎仪80W等。 三、试验动物 SPF级14．5dC57BL／6孕鼠(雌雄比例为2：1，晚8点合笼过夜，第二天检 试验动物中心，许可证编号：SCXK(zlL京)2004．0001。 实验方法 一、体外胚胎胸腺器官培养(FToC)方法的建立 将无菌明胶海绵置于24孔板中，将经消毒处理过的无菌0．8pm微孔滤膜(剪 成直径约lml的圆形)置于凝胶海绵上。分为两个实验组，第1组加lml的培养 C57BL／6胎鼠胸腺，随机分 液I；第1I组加lml的培养液II。无菌取胎龄14．5d 别放置在浸于不同培养液中的滤膜上，一个胎鼠的两个胸腺小叶放入不同的实验 组，每孔4个小叶。胚胎胸腺器官保持在气液界面中，置37℃，5％体积分数C02 孵箱孵育，每隔3d更换培养液。隔天检测胚胎胸腺细胞亚群随体外培养时间延长 的变化。 二、不同胎龄胎鼠体内胸腺细胞表达75TCR的时相 采用荧光抗体标记、流式检测技术，分别检测12．5d、13．5d、14．5d、15．5d、 16．5d各胎龄C57BL／6胎鼠体内胸腺细胞表达1,STCR的时相。 三、刺激因素的浓度及其促进增殖的时相 察不同浓度的Mtb．Ag对C57BL／6小鼠胸腺细胞的增殖变化。以刺激因素的最佳 浓度和14．5d胎龄C57BL／6小鼠胸腺单细胞悬液体外共培养，分别于第0、2、4、 2 6、8 d标记丫链荧光抗体，检测胸腺丫6T细胞的增殖时相。 四、纯化胸腺76T细胞与CFSE染色 制备14．5d胎龄C57BL／6小鼠胸腺单细胞悬