人参皂甙Rg1对海马神经前体细胞增殖能力的影响及其机制研究.pdf

THESISFORTHEDEGREEoFPh．D． MEDICALSCIENCES PEKINGUNIONMEDICALCOLLEGE＆CHrNESEACADEMYOF 人参皂甙Rgl对海马神经前体细胞增殖能力的影响及其机制研究 中文摘要 中枢神经系统的大部分神经元处于终末分化状态，受损后无法再生。近 年来，研究者在胚胎神经组织和成年脑内均找到了这样一群特殊的神经细 胞，它们不但终生保有自我更新能力，而且还具备了多向分化的潜能，因而 被称为“干细胞”或“前体细胞”。从理论上讲，这类细胞有可能能够替代 那些由于疾病，外伤等原因而受到损害的神经元，因而有极大的应用前景。 目前阶段，与此相关的研究主要集中在两个方面：1)从胚胎或成年脑组织中 养，扩增和某些基因操作，然后再将它们移植回受损的脑组织中；2)运用某 些手段诱导体内的NSCs／NPCs发生增殖，分化，进而达到所谓“自我修 复”的目的。十年来，以上两方面的研究工作吸引到了大批科学家的参与， 并且都取得了～些突破性的进展。值得注意的是，这些工作大多以啮齿类动 物为研究对象。一旦涉及到人类，神经干细胞的体外培养，移植等项工作便 会遇到来源不足，不符合社会伦理道德观念等多方面的问题。因此，越来越 多的研究者把目光转向了对体内干细胞进行诱导性操作这一方向。从药理学 角度考虑，积极寻找能够影响NPCs增殖分化功能的化合物，无疑会为神经 系统疾病的治疗打开一条全新的思路。 作为一种珍贵的滋补品，人参在中医中的应用已有了两千多年的历史。 现代医学证明，人参具有促智，抗衰老等多种药理作用。人参皂甙Rgl是从 人参中分离提取出的活性单体成分之一，它具备了人参促进学习记忆，延缓 与衰老相关的功能低下等多项功效。本组以前的研究工作发现，Rgl能够通 过促进脑内蛋白质合成，增加断乳小鼠脑皮层厚度和突触数目来提高啮齿类 动物神经功能的可塑性。由于成年哺乳动物脑内NPCs的存在也被认为是一 种神经可塑性的体现，可以设想，对脑内NPCs增殖分化状态产生影响很可 能是Rgl发挥中枢药理作用的机制或途径之一。基于此，我们设计进行了本 项实验，从体内外两个角度观察了Rgl对NPCs增殖，分化和存活等多项功 能的影响。 6 THESISFORTHEDEGREEOFPh．D， PEKINGUNIONMEDICALCoLLEGE＆CHINESEACADEMYOFMEDICALSCIENCES 第一部分：胎鼠神经前体细胞培养方法的建立及鉴定 分离孕16—18天胎鼠的双侧海马组织，将其分散为单细胞后接种于内含 DMEM／F1 bFOF的干细胞生长培基中，大约7天 2(1：1)+2％B27+20ng／ml 之后便会有大量的悬浮神经球形成。将这些神经球消化为单细胞悬液后传 代，6-8天即可形成新一代神经球。一般讲，细胞经过5-6次传代即进入生长 中，神经球内的细胞会分化产生成熟的神经细胞。 我们采用MTT法观察了细胞的生长特性，结果发现，在D／F，D／F+B27 这说明该培养体系中的大部分细胞具有bFGF反应性。 免疫细胞化学实验的结果进一步证实了培养细胞的干细胞特性。首先， 神经球内的大部分细胞可表达神经前体细胞特异性的神经巢蛋白，同时还能 摄入胸腺嘧啶核苷的类似物…BrdU，表明悬浮神经球内的多数细胞是正在分 裂的原始神经细胞。其次，在分化培养基中生长8天之后，来自一个神经球 的细胞可分化成为B-Tuj一Ⅲ免疫阳性的神经元，GFAP阳性的星形胶质和 Gal-C阳性的少突胶质等三种主要神经细胞。免疫荧光双标也进一步证明了 神经球内细胞的多向分化潜能。 第二部分：人参皂甙Rgl影响神经前体细胞增殖能力的体内外研究 本实验采用MTT，3【H】胸腺嘧啶核苷摄入，克隆形成率等多种方法评价 了人参皂甙Rgl对体外培养神经前体细胞增殖能力的影响。结果显示，0．5— 2．5p．mol／L 0．1 成数可以从另一个侧面反映细胞的增殖状况，我们发现，以5000／孑L的密度将 细胞接种于96孔板内，培养8天之后，Rgl组形成的克隆数显著多于对照 组。以上实验的结果提示，Rgl确实具有促进体