DNA序列测定-DNA的提取.pptVIP

第五节 DNA的提取 一、DNA的提取 1、材料：动物、植物、微生物 2、试剂： 组织匀浆液：NaCL, Tris-HCL, EDTA, 低温 离心：4 ℃，5 000 rpm ,1min 裂解液： NaCL, Tris-HCL, EDTA，蛋白酶K,55℃,过夜 RNase: 37℃ ,1h 等体积酚/氯仿抽提，10 000 rpm ，10min, 4 ℃ (重复) DNA水相，例外情况 沉淀（-20 ℃ ，1-2 h）、洗涤，离心，干燥 TE回溶，低温保存或电泳检测（0.3%凝胶，下层铺1%支持胶）。 注意事项 植物材料：样品处理，液氮 2、试剂： 细胞提取液：NaCL, Tris-HCL, EDTA,SDS，KCL，β-巯基乙醇， 65 ℃水浴，20min 离心：4 ℃，5 000 rpm ,10min RNase: 37℃ ,30min 等体积酚/氯仿抽提，10 000 rpm ，10min, 4 ℃ (重复) 沉淀（-20 ℃ ，1-2 h）、洗涤，离心，干燥 TE回溶，低温保存或电泳检测（0.3%凝胶，下层铺1%支持胶）。注意 第六节 DNA序列测定 一、DNA序列测定 三、核酸序列分析的目的意义和策略（具体方法） 四、测序的常用方法 （四）用于测序的变性凝胶电泳 胶长40cm，厚度均匀 4~8%丙烯酰胺 7mol/L尿素 一、化学裂解法测序的原理 1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端 2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列 三、化学裂解法的特点 不需酶催化 5 ′和3 ′端均可标记，可从两方向测同一DNA 操作繁琐、费时、分辨率较低 方法三 DNA测序自动化和大规模测序 特点 原理同末端终止法 标记物为荧光染料： 4种荧光染料分别标记ddNTP 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 200bp/h DNA自动测序与手工测序的不同点 1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物 2、加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳 3、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑 大片段DNA的测序方法 （一）随机法 超声波处理：将DNA随机断裂成一组相互重叠的300~900bp片段，电泳回收300~600bp片断作亚克隆 DNaseI切割：将DNA随机切割成一组相互重叠的片段，作亚克隆 限制酶消化：限制酶将DNA切割为含粘端的DNA片段，作亚克隆将上述含不同子片段的亚克隆扩增后进行测序 （二）嵌套缺失法 DNA序列测定模板制备方法 因为DNA是相当大的分子，一般由几kb组成，最小的质粒和病毒也在1kb以上，而测序的最好方法，一次也只能测几百个bp（以300-500bp为好，300bp最佳），所以测序前，可以用2种限制酶消化待测DNA，使其降解成小片段，用琼脂糖凝胶电泳分离回收。回收片段，如果超过700-800bp，则进行第二次限制酶消化，再次分离回收。然后分别测定每个片段的顺序。由于两种限制酶在DNA链上的切点位置不同，产生的片段之间有交错重叠顺序，据2片段的这种末端重叠现象，用计算机定出各片段的位置，而排出DNA的全部序列。 在测序中，小片段DNA只需直接克隆到M13mp或者质粒载体中，进行双链或单链模板测序。现在常用的M13mp载体一般是成对设计，如M13mp18与M13mp19都有相同的多克隆位点，但方向相反。同一待测的DNA片段分别克隆到这两个载体中，用一通用引物进行测序。对于数kb大片段DNA分子，则有几种策略，如定向克隆，内部片段克隆，原位亚克隆，包含上述用2种限制酶消化DNA等。 * * 即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。 　　 1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和MaxamG