MTT细胞毒性检测方法.pptVIP

MTT的配制 MTT一般最好先用现配。 过滤后4度保存两周，或-20度长期保存（避光），避免反复冻融 MTT对菌很敏感 ，配成的MTT需要无菌 当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了 实验步骤 1:接种细胞 4. 96孔板边缘孔用无菌PBS填充 或培养液 5. 防止药物与MTT反应。 6. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。 现代应用 * 细胞毒性检测方法 ——噻唑蓝比色法（MTT法） 细胞毒性检测 细胞形态学观察 细胞生长状态观察 细胞活性检测 细胞活性指标 细胞膜对核酸染料的通透性 代谢活性 膜电位 噻唑蓝比色法 噻唑蓝（MTT）比色法是目前应用最广泛的一种检验细胞活性的方法 原理：线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶解的蓝色结晶甲瓒Formazan，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能. 细胞活性 琥珀酸脱氢酶活性 Formazan含量 悬浮细胞： 1.5~1×105/ml 贴壁细胞：4~5×104/ml 100ul/well 加药（浓度梯度） 2:培养细胞,设置适宜的时间点 可根据试验目的和要求决定培养时间 （24h,48h,72h） 3:呈色 每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)10ul.继续孵育2~4 h后，加MTT buffer 100ul,过夜孵育 4:比色 用酶联免疫检测仪 测其吸光值(570nm-650nm) 注意事项 1．?选择适当的细胞接种浓度和时间。 2．??避免血清干扰 3. 设置空白孔 、对照孔。为减小误差，每组设置三个复孔 7 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制。 8 加完板后，将板平握手中，向左三下，向右三下，再往返回复三下移动，使细胞分散均匀 药物药效试验 细胞筛选培养 药物毒性检测 现代 应用 基因工程 * * * 悬浮细胞 1: 收集对数期细胞，计数后，调节细胞悬液密度1.5~1×105/ml ,每孔铺100ul细胞，按药物浓度梯度加药 3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值） 4、每孔加入100 ul MTT buffer，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。 5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔