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细胞工程 Chapter 4 Animal Cell Culture ◆ Biology of cells in culture ◆ Fluid for cell culture ◆ Standard cell culture techniques ◆ Establishing a cell line or cell strain ◆ Cell freezing and recovery ◆Animal Cell Engineering◆ Section 5：细胞的冻存、复苏和运输 1.细胞冻存 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 2.细胞复苏 在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）。 细胞的冻存与复苏 要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几个问题：冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂，冷冻保存温度。 冷冻速率：慢冻（？） 复苏速率：快融（？） 冷冻保护剂：5－15％甘油或二甲基亚砜（DMSO） （？） 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮） 对大多数有核哺乳类动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冻存物。 目前冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。 具有渗透性的冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子的物质，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等，。 非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羟乙基淀粉等。 为什么要加冷冻保护剂 冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，冰晶导致细胞损伤甚至死亡。 甘油或二甲基亚砜可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，可使细胞内水分逐步透出，避免大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。 复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。融化速度快，还可使迅速通过最易受损的-5－0度 冻存和复苏的原则：慢冻快融 冻存方法 1）预先配制冻存液： 含10%－20％血清的培养基＋ 10% DMSO或甘油 2）取对数生长期细胞，经胰酶消化（或离心）后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml) 3）加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 慢冻程序 标准程序： 当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min（4 ℃ 冰箱存放30min） 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min（ -20℃ 冰箱存放1.5-2h ） 当温度达-80℃时，可迅速放入液氮中（ -70℃ 冰箱存放4-12h） 转入液氮罐，注意登记！ 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 复苏方法 （l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。 （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 （3）低速（800－1000rpm）离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。每日观察细胞生长情况，若死细胞较多，次日应换液。 3.细胞的运输 ◆ 贴身运输 ◆ 冰瓶运输 ◆ 液氮罐运输 1、体外培养细胞有哪些类型？什么是细胞系、细胞株？ 2、细胞系的生长过程包括哪些主要阶段？每一生长阶段各有什么特征？ 3、每代细胞的生长曲线包括哪几个主要时期？各期细胞有什么特点？ 4、培养细胞与体内细胞相比发生了哪些变化？ 5、什么是天然培养基、合成培养基和无血清培养基？无血清培养在实验研究中有什么特殊意义？ 6、简述原代培养中的组织块培养法的基本过程。 7、贴壁细胞传代时采用何种方法，其技术关键是什么？ 8、简述细胞冻存和复苏的技术要点。 思 考 题 细胞培养技术.rm 一、常用设备与器材 二、玻璃器材的清洗、包装与消毒 三、过滤器的清洗、包装与消毒 四、培养液的除菌 五、无菌操作 六、细胞的原代培养 七、细胞的传代培养 八、细胞的冻存 九、细胞的复苏 细胞工程