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PCR产物的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收 限制性内切核酸酶消化DNA 限制性内切核酸酶（restriction enzyme) 是一类识别DNA上3-8个特定核苷酸序列并产生切割反应的内切核酸酶(endonuclease)的总称。在基因操作中，这些酶作为“剪刀”对DNA起剪切作用，是分子生物学研究中不可缺少的酶之一。 在酶切实验中： 如果用同一种酶切割载体和插入DNA两者能正确连接，但不能确定方向。 如果用同的限制酶切割，所得的单链突起能互补，则两者能正确连接。但也不能确定其方向。 若限制酶切割所得的片段是平末端，虽能连接，但效率低，而且不能确定其方向。 用两种不同的限制酶共同切割载体和插入片断，而且所得两末端结构不同，连接后就能确定其方向。 因此，运用两种不同的限制酶的模式被广泛应用。 在我们今天的实验中，用到两种限制性酶分别是BamH I 和Hind III ，这两种酶切割后产生的片段都具有粘性末端，可以保证酶切产物与载体正确的连接。 酶切体系 PCR产物 0.5μg Buffer K（10X） 5μl ddH2O 加至 48μl BamHⅠ（20U/ul） 1μl Hind III （20U/ul） 1μl 总体积 50μl 将酶切体系按顺序加好后柔和混匀，放入已预热的37℃的水浴锅（或37℃培养箱）中，使反应体系在这个温度下进行酶切。 在酶切实验中需要注意的事项 1 反应Buffer 2 酶切位点的保护碱基 3 酶切反应温度 4 酶切体系的体积 每一种酶都具有相应的反应缓冲液，反应缓冲液可能相同也可能不同。一般同一公司的酶的缓冲液可以通用，不同公司的一般不相同。 若不同酶使用相同的缓冲液，则可同时加入，若使用不同的缓冲液，则只能在第一个酶切完成后，进行酚抽提，乙醇沉淀，再进行另一个酶的消化。 保护碱基 限制性内切酶的酶切位点两侧的保护碱基是在设计PCR的引物时加入的。 BamH Ⅰ的保护碱基 ATTGGATCCATGGCGAATTCCGGCGAAGA Hind III的保护碱基 ACCAAGCTTGATGGTGGAAGAAGGAGC 酶切反应温度 ３７°C对于大多数酶来说是最佳反应温度。 实验中应注意反应的温度。在我们的实验中使用水浴锅提供酶反应的温度，但是由于水浴锅中离心管底部的温度与管顶的温度不同，易造成反应体系的蒸发，这样会造成酶反应条件的改变，可能会造成酶产生星活力。因此，如酶反应时间较短，在两小时左右，可在水浴锅内进行，如时间较长，最好在培养箱内进行反应，可避免水分蒸发和凝结。 酶切体系的体积 我们今天的酶切体系是50μl。在反应中加入的酶量不能超过总体积的十分之一。 并不是在酶切中加入的酶越多越好，因为在酶的储存液中含有甘油，甘油可以保护酶，防止酶结冰，失去活性。而当甘油达到一定的浓度，（在反应体系中〉10%），就会影响酶，产生星活力，切割出我们不需要的片段。 星号活力 又称为第二活力，是指改变了酶切反应条件后特意序列的识别特性降低的一种现象。由于识别特异性降低，可能对原识别序列相似的序列也产生切割。如EcoR Ⅰ的典型识别序列为 GAATTC，条件改变后，其识别序列由原来的六核苷酸降为四核苷酸 AATT。高浓度甘油、高PH、低离子强度、DMSO、β-巯基乙醇、Mn2+ 等的存在可能导致酶产生星活力。 从琼脂糖凝胶中回收DNA 在酶切的过程中，除产生我们所需要的目的片段外，还会产生一些小片段，这些小片段具有和目的片断同样的黏性末端，也可能会与载体连接，从而产生干扰，去除这些小片段的最好的方法就是进行琼脂糖凝胶电泳。 离心柱法回收凝胶中的DNA 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条置于1.5ml离心管中； 加入3体积溶胶液，50~60℃数分钟直至无可见凝胶块； 冷却至室温； 加入到离心吸附柱中，室温放置1min后，5000～10000rpm 1~5min使液体滤过；倒掉离心管中液体； 向离心柱中加入600ul漂洗液，10000rpm 2min洗涤一次；倒掉离心管中液体 向离心柱中加入600ul漂洗液，10000rpm 2min洗涤一次；倒掉离心管中液体； 将离心柱放入离心管中12000rpm 2min； 将离心柱放入新的1.5ml离心管中，向离心柱中滤膜上加入20~30ul洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心3min，液体中即为回收的核酸。 注意事项 电泳所用的胶的浓度为0.7%，易于回收核酸。 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光