双向凝胶电泳的基本原理和方法.ppt

第五章 双向凝胶电泳(2D) 蛋白质组分析的技术路线 双向凝胶电泳技术的发展及原理 仪器简介 样品制备 技术流程 1. 蛋白质组分析的技术路线 要求 流程 技术路线 蛋白质组分析的首要要求 　　将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。 2. 双向电泳技术的发展及原理 双向凝胶电泳的发展 双向凝胶电泳的基本原理 双向凝胶电泳的发展 　　双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率 (free-solution mobility)，在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。 　　随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:711)，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyac-rylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)，这即是双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE)。 　　同年，2D PAGE在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF(Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seyler’s Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。 　　20世纪70年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠 (SDS) (Barrett T, Gould HJ. Tissue and species specificity of non-histone chromatin proteins. Biochim Biophys Acta, 1973, 294: 165-170；Martini OHW, Gould H. J. Enumeration of rabbit reticulocyte ribosomal proteins. J Mol Biol, 1971, 62: 403-405；Stegemann H. proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die anwendung auf die genetische analyse bei pflanzen. Angew Chem, 1970, 82: 640)，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了现代双向凝胶电泳的基础，即IEF-SDS PAGE。 　　1975年，O’Farrell、Klose和Scheele分别对双向凝胶电泳做进一步的优化，建立了高分辨率的双向凝胶电泳 (O’Farrell PH. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem, 1975, 250:4007-4021；Klose J. protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik, 1