弓形虫病PCR和ELISA诊断方法的建立和初步应用.pdf

弓形虫病PCR和ELISA诊断方法的建立和初步应用 摘 要 弓形虫是细胞内寄生虫，能感染大多数哺乳动物。弓形虫感染畜禽，可使妊娠 家畜受到严重威胁，尤其给猪、牛、羊饲养业带来严重的经济损失。由于临床上弓 形虫病缺乏特异性临床症状和体征，诊断仍是弓形虫病防治中一个突出的问题。目 前，临床上常用、也是目前我国卫生部门推荐的，还是血清学检测方法。但其仍存 在一些问题，如出现交叉反应，又多受机体免疫状态以及方法本身敏感性和特异性 的影响，容易出现误诊和漏诊。同国外的一些试剂盒相比，目前我国还缺少令人满 意的试剂盒。诊断试剂盒中存在的一个主要问题是包被抗原的纯度或抗原活性不够， 导致检出的准确率不高，为此，我们探讨利用SAGI体外表达产物作为抗原建立弓 形虫ELISA诊断试剂盒的可行性，并进行了临床上应用，取得了较好的结果。同时 本研究还建立了弓形虫的PCR诊断方法，并初步应用于临床检测。 1．弓形虫聚合酶联反应(PCR)方法的建立和初步应用： 通过对弓形虫各种抗原性的比较，选择SAGI基因中比较保守的一段序列设 计了一对引物，扩增出长度270bp的片段，建立了检测弓形虫病的PCR诊断方法， 并对该方法的灵敏性和特异性进行了研究：将虫体个数计数后提取模板DNA进行 PCR，结果表明当稀释到相当于O．85个虫体的DNA量时结果还是阳性。对临床上几 种流行猪病和两种寄生虫病的病料进行检钡4，结果都没有扩增出目标片段，上述结 果表明，该方法敏感性高、特异性强。在此基础上对送检的85份抗凝血样进行了检 测，其中检出阳性34份，阳性率为40％。实验结果表明，弓形虫PCR诊断方法是临 床检测弓形虫病的一种行之有效的方法。 2．弓形虫SAGI基因重组质粒的构建与表达产物抗原性的分析 根据Genebank上公布的弓形虫SAG I的序列设计合成弓l物，PCR扩增和克隆了 SAG I基因主要表面抗原部分编码区段，并测定了核苷酸序列。克隆的SAG I基因 相融合的表达蛋白，具有抗原性。这为下一步大规模获取SAGI进行疫苗研究和诊 断试剂的开发提供了条件。 3．弓形虫主要表面抗原性基因SAGI基因表达蛋白ELISA方法 的建立和初步应用 I基 利用在大肠杆菌中最佳的表达条件下体外表达了弓形虫主要膜表面抗原SAG 因，提取、纯化表达蛋白形成的包涵体，用提纯的包涵体包被ELISA板来检测抗弓 形虫抗体，建立了弓形虫SAGI蛋白的ELISA诊断方法。用该方法对猪的几种其它 弓形虫病PCR和ELISA诊断方法的建立和初步应用 传染病做了检测，检测结果均为阴性：随机抽取了5份不同抗体水平的血清，用不同 批次包被的酶标板进行检测，结果变化不大；用该方法和间接血凝抑制对300份血清 进行同步检测，两者符合率为98％，比间接血凝抑制实验阳性率高。上述结果表明 l 该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点。而且包被抗原采用的是SAG 基因的表达产物，不是直接用虫体做抗原，减少了操作人员被感染的机会。 关键词：弓形虫；SAGI基因；PCR：克隆：表达；ELISA 弓形虫病PCR和ELISA诊断方法的建立和初步应用 Abstract isan intracellular itinfects mammals，It Toxoplasmaobligate parasite，andmajority threatensthe causes lossfor of animals，andgrave pregnant