HBV+cccDNA荧光定量检测方法建立与新型核苷类抗乙肝病毒化合物体外筛选.pdfVIP

中文摘要 HBV cccDNA荧光定量检测方法的建立与新型核苷类 抗乙肝病毒化合物体外筛选 研究生：杨晓瑞 导师：郑立运 郑州大学药学院 河南 郑州450052 中文摘要 Bvires，HBV)感染导致乙型肝炎的发生，严重威 乙型肝炎病毒(Hepatitis 胁着人类的生命健康。目前的治疗药物存在毒副作用大、价格昂贵、不能完全清 除病毒且易产生耐药性等诸多问题。因此，寻找新型的抗HBV药物，成为当前 closedcircularDNA， 研究的热点。目前认为，HBV共价闭合环状DNA(Covalently eccDNA)是乙肝病毒复制的第一中间体，是HBV存在和持续复制的根本原因。 因此，开展对HBVeccDNA的定量检测，对于判断HBV在肝细胞内复制的状况 具有重要的意义，使之能够更准确的评价抗HBV药物的疗效。本文首先建立了 cccDNA 一种HBV SYBRGreen I荧光定量PCR检测方法；然后应用HepG2．2．15 合物进行初步体外筛选，力求获得低毒、高效的抗HBV候选药物。 cccDNA荧光定量检测方法的建立． 第一部分；HBV 旧的】建立一种稳定、特 cccDNASYBRGreen 异、敏感的HBV I荧光定量PCR检测方法。【方法】根据HBV 松弛环状DNA(relax Dnase，PSAD)提高反应的特异性；建立荧光定量PCR标准曲线，并 dependent 进行特异性、敏感性和重复性检验。应用所建立的方法评价拉米夫定和阿德福韦 酯对HBV cccDNA，在 cccDNA的抑制效果。【结果】该方法能特异性检测到HBV HBV c优DNA均有很好的抑制效果。【结论】该实验所建立的方法稳定性强、特异 性好、灵敏度高，可快速定量检测HBVcccDNA，用于抗HBV药物的评价。 中文摘要 第二部分：抗HBV化合物体外筛选研究。咀的】从60种新型核苷类化合物中 筛选出具有体外抗HBV活性的新型化合物。【方法】选用拉米夫定(3TC)作为 样品作用后第3、6、9天细胞上清液中HBsAg和HBeAg的变化，以细胞的半数 60个受试样品进行初筛，筛选出具有体外抗HBV活性的样品，然后应用实时荧 光定量PCR法检测活性样品对HBVDNA和HBVcccDNA含量的影响，从而对 样品的抗HBV活性做出进一步的评价。【结果】(1)对60个受试样品进行初筛， 试样品，根据毒性测定结果设定合适的筛选浓度，结果显示核苷类化合物 DNA含量，平均 0．MM、0．01／lfM时，显著影响HepG2．2．15细胞上清中的HBV DNA含量也均产生显著影响，其平均抑制率分别为 HepG2．2．15细胞内的HBV x103、6．06± 细胞内HBVcccDNA含量分别为0．59±0．2x103、3．02±0．43 与正常对照组13．78±0．78x103 copies／／d相比，其含量有明显的下降，差异具有 病毒抗原、HBVDNA及HBVcccDNA，在体外具有低毒高效的抗HBV作用， 有望成为抗HBV的候选药物。 第三部分： 结论。概括叙述了本课题的主要研究成果及意义。 第四部分：文献综述。概括介绍了核苷类抗乙肝病毒药物研究进展和HBV cccDNA研