壳聚糖基因纳米粒子对免疫细胞影响.pdfVIP

摘要 壳聚糖是由甲壳素脱乙酰基转化而来的一种阳离子多糖，具有良好的生物降解性 和生物相容性，可与带负电荷的DNA通过静电作用形成纳米级颗粒，可使DNA免 受核酸酶的降解，作为一种具有潜力的基因载体材料，日益引起研究者广泛的关注。 壳聚糖作为基因载体的主要缺陷是转基因效率比较低，所以研究者们试图通过修饰以 增加壳聚糖的转基因效率。我们实验室的前期工作显示，采用精氨酸和十六烷基修饰 壳聚糖，可以明显改善其转基因效率。但修饰后的壳聚糖和DNA形成的纳米粒子对 免疫细胞的影响如何，目前还没有相关研究报道。 本研究选用壳聚糖基因纳米粒子(Chitosan．DNA modifiedchitosan．DNA 化壳聚糖基因纳米粒子(Arginine modifiedchitosan-DNA 六烷基化壳聚糖基因纳米粒子(Hexadecylated nanoparticles， HCGN)，并就其对初始T细胞和人单核巨噬细胞系THP．1功能的影响进行了初步 研究。研究内容主要分为五个部分： 1筛0备去除内毒素的质粒DNA，壳聚糖及其上述两种修饰物与DNA按照N／P比 4：1的比例采用复凝乳方法制备纳米粒子；采用粒度及zeta电位分析仪进行表征。结 nnl。 果：CNP、ANP和HNP的zeta电位分别为12．1．14．63mV，粒径约为148．07．179．47 内称下室，初始CD4十T细胞于小室内培养，THP一1细胞于24孔培养板中培养。将上 述三种材料与DNA形成的纳米粒子分别以5 lag／ml的浓度(以DNA的含量为标准， h、24h、48 后同)与THP．1细胞共孵育12 h后检测THP．1细胞上清中IL～12的浓 度和初始CD4+T细胞上清中细胞因子IL一4、IFN吖的浓度，以观测纳米粒子是否刺 激初始CD4+T细胞分泌细胞因子的增加，从而判断纳米粒子刺激初始CD4+T细胞的 分泌增加，即不会引起初始CD4+T细胞的分化。 和48小时以后分别取上清，离心，分别检测IL-4和IFN吖的含量，结果显示壳聚糖 及其衍生物的基因纳米粒子并未刺激初始CD4+T细胞这两种细胞因子的分泌增加， 说明纳米粒子不会直接激活初始CD4+T细胞。 4．初始CD4+T细胞接种到一个24孔板中，细胞密度为l×10。，每孔1m1，设 六组，每孔加入5ng／ml的人重组细胞因子IL-4(RDSystem3×101IU／rtg)，另一 24孔板设计同上，不同之处在于向初始CD4+T细胞培养基中加的细胞因子是人重组 IFN吖(RDSystem 2×101IU／pg)。结果显示，壳聚糖及其衍生物的基因纳米粒子 5．采用荧光素异硫氰酸酯(FITC)荧光标记壳聚糖及精氨酸修饰的壳聚糖， 标记后的壳聚糖与DNA制成基因纳米粒子，以3．125 ttg／ml，6．25ttg／ml，12．5l上g／ml 果显示THP_l细胞对纳米粒的摄入随着纳米粒的浓度的增加而增加，在同等浓度下， 调理作用有关。 响作用。 关键词：壳聚糖，精氨酸修饰壳聚糖，烷基化修饰壳聚糖，纳米粒子，Th0细胞， 细胞分化 II Abstract dervativeof acationic has Chitosan，thedeacetylated chitin，is welldefinedwithcharacteristicsthatinclude and been go