青霉素工业生产菌株—产黄青霉菌转基因体系建立.pdfVIP

中文摘要 青霉素工业生产菌株产黄青霉菌转基因体系的建立 摘 要 目的：青霉素是人类发现的第一个抗生素。由于青霉素 具有的高效、低毒、耐酶和长效性等特性，长期以来被广泛 应用；以青霉素为原料经化学法或酶法生产母核6-APA、 抗生素产品发展到70多种，占世界抗感染药物市场份额的 2／3，使母体青霉素至今在临床应用和医药工业中仍占有极其 重要的地位。产黄青霉(Penicillium 工业生产用菌，为了获得更高的产量，其菌种改良成为青霉 索工业的主要研究课题。现代分子生物学技术，特别是代谢 途径工程研究的进展，使得我们可以通过外源基因的导入， 有目的地改造产黄青霉的代谢途径，从而突破产量瓶颈，甚 至产生新的物质，实现菌种选育的理性化。高效的基因转化 系统是利用分子生物学进行菌种改造的基础，包括具有合适 的真菌选择标记的载体和有效的基因转化条件。此外，用基 因工程技术改造产黄青霉工业生产菌株，需要根据不同的研 究目的选择合适的调控元件，如不同的启动子等对外源基因 进行调控。为此我们从载体构建、转基因体系建立、启动子 筛选评价等方面进行了实验，为开展产黄青霉工业生产菌株 的代谢途径工程以及功能基因研究创造条件。 方法： 1产黄青霉菌工业生产菌株耐药性调查，确定筛选标 记。 中文摘要 2通过PCR方法克隆抗性基因及不同基因的启动予。 3不同调控元件产黄青霉菌转化载体的构建：以上述真 菌基因转录的不同启动子构建转化产黄青霉菌载体。 4产黄青霉菌工业生产菌株原生质体制备。 5产黄青霉菌工业生产菌株原生质体转基因方法建立。 6比较不同载体的转化效率及腐草霉索抗性表达的强 弱，确定启动子的启动活性 结果：产黄青霉对腐草霉素非常敏感，1099／ml的腐草霉 ble 素抗性作为筛选标记，克隆腐革霉素抗性的编码基因Sh pDHB和pDHCB。 本实验确立了丝状真菌产黄青霉菌原生质体制备的快 速大量制备方法，在30 234酶中 oc温度下，1％Novozyme 酶解3h，原生质体释放量可以达到7-8×107个儋湿菌丝， 再生频率14％以上。该方法制备的原生质体数量、再生频率 能够满足原生质体转基因方法的需要。 建立了PEG介导的工业生产菌株原生质体转基因方法， 个／ugDNA。通过腐草霉素抗性培养基选择，转化子有明显 中文摘要 的区别，通过PCR分析，筛选到的转化子均为阳性克隆。 对构建的四种转化载体的转化效率进行了比较。根据转 DNA 效率较为接近，转化效率分别为6．2、4．4个阳性克隆／ug 是低效的转化载体。对这四种质粒转基因所得的阳性克隆进 行腐草霉素抗性调查，结果表明pDHGB的阳性菌落对腐草 种质粒的转基因效率的结果相符。这四种启动子强弱的顺序 C。 为Pgpd、Pope、Pipns和Ptrp 结论：本实验以腐草霉素抗性基因作为产黄青霉菌转基 因载体构建的选择标记。分别构建了以产黄青霉菌异青霉素 粒。建立了产黄青霉菌原生质体转基因方法，通过比较不同 载体的转化效率和转化子耐药敏感性，建立了产黄青霉菌工 业生产菌种启动子筛选、评价体系，确定了四种不同基因启 C。 动子的强弱顺序为Pgpd、Pcpc、Pipns和Ptrp 关键词：产黄青霉菌；启动子；抗性基因；原生质体： 基因转化 英文摘要 of transform