铜绿假单胞菌AmpCβ-内酰胺酶的活性表达与耐药性的关系研究.pdf

中 文 摘 要 铜绿假单胞菌AmpC0一内酞胺酶的活性 表达与耐药性的关系研究 摘 要 目的:AmpC0一内酞胺酶(下简称AmpC酶)是头抱菌素 酶，最初是在耐氨节西林的大肠杆菌中发现并根据其耐药性 而取名为AmpC酶，现在AmpC酶的概念有了很大的拓展， 它代表由革兰阴性杆菌产生的不被克拉维酸抑制的 “丝氨 酸”头抱菌素酶组成的一个酶家族，为Bush分类C组I型 酶.AmpC酶由革兰阴性杆菌尤其是肠杆菌科细菌及铜绿假 单胞菌染色体介导产生，由ampC基因编码。产酶菌株对0 -A酞胺类和0一内酷胺类联合酶抑制剂抗生素及单环0内 酞胺类抗生素广泛耐药。 目前认为，革兰阴性杆菌对p一内酞胺类抗生素耐药的 主要原因是产生质粒介导的超广谱酶 (ESBLs)和由染色体 介导的ClassC酶，如AmpC酶。AmpC酶由ampC,ampR. ampD,ampE和ampG等几个不连续的基因调控表达。这些 基因的突变均可导致AmpC酶活性或表达水平的改变。其 中以ampD基因的突变最多见。当ampD发生去阻遏突变时， 可引起AmpC酶持续高水平表达，导致细菌对0一内酞胺类 抗生素广泛耐药。根据ampR基因是否存在，AmpC酶又分 为诱导酶和非诱导酶.AmpC酶以诱导酶和非诱导酶存在于 不同细菌中。部分肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌在无p一内 酸胺类抗生素诱导剂时，只产生少量的AmpC酶，当有诱 导剂时，则产生高水平的AmpC酶。因此这类酶又称诱导 中 文 摘 要 酶。产诱导型AmpC酶菌株的特点是对酶抑制剂不敏感， 对0一内酞胺类抗生素耐药或潜在耐药。因此检测产AmpC 酶耐药株或潜在耐药株，对临床正确应用抗生素有重要意 义。 关于肠杆菌科细菌AmpC酶的研究在国内已多有报道， 而铜绿假单胞菌产AmpC酶导致的耐药情况报道较少。本 研究对本地区铜绿假单胞菌临床分离株进行了药敏试验，测 定了AmpC酶的诱导率，检测了诱导前、后AmpC酶的存 在状况，进行了ampC结构基因的扩增试验，以了解目前铜 绿假单胞菌产AmpC酶情况，并分析常用抗生素对产酶株 及非产酶株的抗菌活性，为临床合理应用抗生素治疗铜绿假 单胞菌的感染提供实验依据。 方法:收集临床微生物室近期分离的 130株铜绿假单 胞菌并进行重新鉴定。以阴沟肠杆菌029M作为高产AmpC 酶对照，阴沟肠杆菌029为野生型 (普通诱导型)对照，阴 沟肠杆菌 1194E为高度诱导型对照，以亚胺培南作为诱导 剂，诱导铜绿假单胞菌和3株阴沟肠杆菌标准菌株的AmpC 酶，制备诱导前、后的铜绿假单胞菌和标准菌株p一内酸胺 酶粗提物，在确保无活菌的情况下，对p一内酞胺酶粗提物 进行三维试验，检测诱导前高产AmpC酶菌株以及诱导后 诱导型AmpC酶菌株;并对高产AmpC酶菌株的酶粗提物 进行等电点测定和邻氯西林抑制试验，以确证检出的AmpC 酶;对130株铜绿假单胞菌和3株标准菌株进行ampC结构 基因扩增，扩增产物经纯化处理后测序，并与GeneBank登 录菌种进行同源性比较:采用二倍琼脂稀释法测定130株铜 绿假单胞菌对氨节西林等17种抗生素的MIC值，分别计算 中文 摘 要 铜绿假单胞菌和高产AmpC酶菌株的耐药率:对产酶株和 非产酶株的耐药性进行统计学处理，分析比较耐药性的差异 性。 结果:用三维试验对诱导前的铜绿假单胞菌酶粗提物 进行检测，结果26株阳性，检出率20% (26/130)。等电聚 焦试验显示这26株存在PI值偏碱性且能被邻氯西林抑制的 等电点条带，证明这些菌株高产AmpC酶。用三维试验对 诱导后的铜绿假单胞菌进行检测，发现 79株产诱导型 AmpC酶，诱导率为60.77%(79/130).PCR扩增结果显示 130株铜绿假单胞菌中有121株扩增阳性，阳性率为93.08% (121/130)，提示潜在的耐药菌株广泛存在。药敏试验结果 显示铜绿假单胞菌对常用抗生素表现出不同的耐药性，对氨 节西林的耐药性最高达到97.69%，对氨节西林/舒巴坦、头抱 西丁、头抱唾肪和氨曲南的耐药率分别为%.15%,96.92%, 69.23%和61.54%，对头抱曲松、替卡西林/克拉维酸