易错PCR介导扩展青霉脂肪酶定向进化的研究.pdfVIP

摘要 摘要 本研究利用易错PCR技术对扩展青霉脂肪酶PEL进行定向进化。以扩展青酶 脂肪酶基因为模板，通过易错PCR和转化毕赤酵母建立了约含13000个突变株的突 变体库；通过酶活性的平板透明圈高通量的筛选获得了约50株的有活性的转化子； 通过酶学特性分析和基因克隆测序，筛选出如下热稳定性和酶活有所改变的突变体。 在最适作用温度下的酶活提高了约22％，Tm值比野生型提高了3．28℃。 最适作用温度下的酶活为950U／mL，Tm值比野生型提高了2．15℃。 作用温度下的酶活为935U／mL，Tm值比野生型提高了2．28℃。 最适作用温度下的酶活为1005U／mL，Tm值比野生型提高了1．8℃。 最适作用温度下的酶活为917U／mL，Tm值比野生型提高了2．25℃。 作用温度下的酶活为1105U／mL，Tm值比野生型提高了2．81℃。 用温度下的酶活为1060U／nlL，Tm值比野生型提高了2．26℃。 用温度下的酶活为425U／mL，降低了约42％，Tm值40．4℃。 (9)突变体HRl、HR2、HR5的最适温度最适作用温度未发生变化，在最适 作用温度下的酶活分别为720U／mL、612U／mL、762U／mL，变化并不明显。 本研究共筛选出十一个突变体，其中七个热稳定性和酶活得以提高的正向突变 体，结果说明易错PCR介导的定向突变是种很好的酶分子改造的手段，这些突变体 的获得为进一步的脂肪酶定向进化打下了基础。 关键词：扩展青霉脂肪酶；易错PCR；最适作用温度；酶活；热稳定性 Abstract Abstract Inorderto the ofthePenieillum improvethermo—stability expansumlipase，alibrary 3000mutantswascreated PCR thePichia of1 andtransformationof byerror-prone witll olive mutants wereidentifiedthe activity pastoris．50 lipase throughhiglathroughput oil furtherflask agar screenand11 mutantswereselectedthe platelipaseactivity by shakecultureand and ofthese11 enzymeactivityassay．Theactivitythermo—stability mutantsweremeasured．The ofthesemutantswere wimPCR encodinggenes amplified the and resultindicatethatallthe11 usinggenomicDNA硒templatessequencing mutantshasonetothreeaminoacidsubstitution． (1)The andTm