rProteinASepharose亲和层析介质与抗体的结合.docVIP

1?Protein A Sepharose 、rProtein A Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合 目前，约70-80%的抗体纯化使用Protein A、Protein G 亲和层析。蛋白A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域。蛋白A作为亲和配基被偶联到琼脂糖基质上，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他杂蛋白流穿，具有极高的选择性，一步亲和层析就可达到超过95%的纯度。1个蛋白A分子至少可以结合2个IgG。蛋白A也可以结合另一些免疫球蛋白，如用于某些种属的IgA、IgM的纯化。 天然 (Native Protein A) 和重组的蛋白A (rProtein A) 对于IgG的Fc段有着相似的特异结合。重组的蛋白A经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位点偶联于琼脂糖上，降低了空间位阻，增加了与IgG 的结合能力。蛋白A 与IgG的结合强度很大成度上依赖于该抗体的种属和亚型，而其动态结合能力则决定于结合强度 (解离常数) 及传质阻力等多种因素(例如上样时样品在柱内的停留时间)。 2 Protein G Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合 蛋白G是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白，为三型Fc受体。其通过类似于蛋白A 的非免疫机制与抗体的Fc段结合。像蛋白A 一样，蛋白G可以与IgG的Fc 区域特异性结合，不同的是，Protein G Sepharose 可以广泛、更强地结合更多类型的IgG, 多克隆IgG及人IgG，同时血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配基脱落也相对更低。此外，蛋白G还可以和某些抗体的Fab 和F (ab’)2 段结合。 3 Protein A 、Protein G 亲和层析方法优化 由于不同抗体与蛋白A或蛋白G的亲和力不同，有必要单独优化结合和洗脱条件和层析柱载量，层析条件优化的过程可以通过用自动化层析系统如AKTA 来自动快速完成。以下是一个杂交瘤细胞培养小鼠单抗的纯化条件探索。 4 MabSelect ——大规模抗体纯化新型蛋白A亲和层析介质 MabSelect 是第一个使用高流速琼脂糖凝胶 ( High flow Agarose) 作为骨架的新型蛋白A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计，适合快速高效的进行抗体生产和放大，已经成为单抗纯化和放大的标准介质。 Mabselect 的特点包括： a. 高流速琼脂糖作为骨架: 介质的刚性和传质性能大大优于传统的Sepharose 4FF 和6FF 琼脂糖骨架，可以在大规模生产时，使用更高的流速而保持更高的载量，大大提高生产效率。 b. 更高的流速和动态载量：蛋白A 经基因工程改造，C 端含一个半胱氨酸，形成一个定向的硫酯键，同时增加了对IgG的有效结合。蛋白A 和凝胶偶联时采用了全新的单点偶联工艺，降低了空间位阻，因此可以在使用更高流速的条件下增加动态载量：在线形流速为500cm/hr 和柱床高度为20cm (停留时间2.4min) 的条件下，每毫升MabSelect 的动态载量可以达到30mg IgG。在纯化特性(杂蛋白去除、产品纯度等) 方面明显优于其它的蛋白A亲和介质。 c. 更低的非特异性吸附，抗体纯度更高：和传统的rProteinA FF 介质相同，Mabselect 介质高度亲水性的琼脂糖骨架最大程度上降低了非特异性吸附，使得洗脱峰中杂蛋白和DNA 更少，有利于后期抗体的精细纯化。著名的抗体生产商IDEC公司以及R. Hahn的研究显示，Mabselect 对CHO 细胞CHOP (宿主蛋白) 的吸附比其它蛋白A 介质如Prosep A 低7倍。Robert L. Fahrner 等对于多种商品化的Protein A 介质的性能进行了研究比较，结果表明:以亲水的琼脂糖凝胶作为骨架的蛋白A 介质所得抗体的DNA 残留量比Prosep A 低30%。 d. 更低的蛋白A 脱落：MabSelect 由于通过新型环氧共价交联技术，蛋白A的脱落比其它同类介质低，这不仅有利于抗体纯化，还延长了介质的使用寿命，降低生产成本。微量的脱落可以在后续的层析中，如凝胶过滤或离子交换层析有效去除。 e. 生产过程无动物血清成分：配基重组蛋白A在大肠杆菌中表达，通过多步柱层析纯化，完全适用于抗体药物纯化。 f. 更易于工艺的线性放大：通过实验室条件的优化，MabSelect 可以在保持线性流速和上样比例等参数不变的条件下，通过增加柱直径进行线性放大。装填在内径为60-80厘米层析柱时，可以在一个工作日处理超过上万升高表达的抗体培养液。 MabSelect 易于清洗与除菌，寿命更长、更经济：在长期连续的生产中，介质寿命是成本效益的一项重要指标，有效的CIP 有助于延长