犬猫3种冠状病毒基因克隆的构建与芯片检测技术.pdfVIP

1284 中国兽医学报 2008年l1月 第28卷 第 l1期 ChinJVetSciNov．2008 Vo1．28 No．11 犬 猫 3 种 李 健 ，熊 炜 ，陈 沁 ，王 权。，王巧全 ，张建武。，胡永强 ，李树清 (1．上海出入境检验检疫局， 状冠。 上海 200135；2．上海大学 生命科学学院，上海 200436；3．中国农业科学院 上海兽医研究所 ，上海 200032) 病 摘要：蔗糖密度梯度 离心纯化浓缩犬冠状病毒 (CCV)、猫冠状病毒(FCV)和猫传染性腹膜炎病毒 (FIPV)的细胞培 毒 养物 ，分别设计 7、17、11对 引物 ，对病毒 RNA进行反转录和 PCR扩增 ，回收 PCR产物连接 pGEM—T载体并转化 基 大肠杆茵TGI，构建 35个基因片段的克隆。煮沸裂解法制备质粒DNA，回收PCR扩增产物，点制冠状病毒基因芯 因 片。抽提病毒总RNA，利用Cy3一dCTP随机渗入反转录PCR标记 ，与芯片进行杂交检测 ，淘汰交叉的克隆片段 ，每 克 种病毒只选择其 4对引物克隆的基因片段。将特异克隆扩增片段重新点制基 因芯片，与病毒样品 PCR扩增产物 隆 杂交，未发现交叉现象。基因芯片检测比传统PCR敏感 1000倍，可有效应用于 3种病毒的检测与区分。 的 关键词 ：冠状病毒 ；克隆；基 因芯片；杂交 中图分构类号：$852．65；R535 文献标识码 ：A 文章编号：1005—4545(2008)l1-3284—04 建 与 Developmentofgenecloneanddiagnosticgenechip forthreecoronavirusesin ca。 芯 nineandfeline 片 LIJian，XIONG Wei，CHEN Qin ，WANG QuaD。，WANG Qiao—quan ，ZHANG Jian—WU。，HU 检 Yong—qiang ，LIShu—qing (1．ShanghaiEntry—ExitInspectionandQuarantineBureau，Shang— 测 hai200135，China；2．CollegeofLifeScience，ShanghaiUniversity，Shanghai200436，China； 技 3．ShanghaiVeterinaryInstituteofCAAS，Shanghai200032，China) 术 Abstract：A totalof7，17and 11pairsofprimerforCCV ，FCV andFIPV separatelyweredesigned．Thetotal RNAsofpurifiedthreeviruseswereextracted，reverselytransferredandPCR amplified．ThePCR productswerepu— rifled，linkedwithpGEM—T—Easyvectorandtransfected intoE．coliTGI．The35eDNAscloneswereobtained．AU theDN6fragmentsreamplifiedfrom theserecombinantplasmidswerespottedon3glass—boundmicroarray．RNA extractedfrom thesethreeviruswere reversetranscripted，followed bymulti—PCR amplificationandlabeledwith Cy3一dCTP．AllthelabeledcDNA andpreparedgenechipweresubjectedtospecifichybridization．Theuhimum spe— cifiegenechipwasdevelopedwith theDNA fragmentsreamplified from theehosed recombinantplasmidswithout