瑞士木霉木糖醇脱氢酶基因的克隆和性质分析以及基因的移码突变.pdfVIP

山东大学硕士论文 摘 要 reeseiJ是自然界中普遍存在并有重要经济意义 j瑞氏木霉(什f(hoderma 的岛十丝状真菌，作为工业生产菌株生产多种水解酶类已有多年历史。随着分 子遗传技术和真菌基因转移系统的发展，利用基因工程方法对丝状真菌进行有 目的的遗传改造，已经成为可能。近年来的实践表明，经过基因工程手段改造 的瑞氏木霉重组菌株是安全无害的。 D．木糖是木质纤维素中大量存在的一种五碳糖，是自然界最丰富的糖类 之一，对它的生物转化具有重要的经济意义。在酵母和某些丝状真菌中，木糖 1．1 1．1．1．9)是由木糖经木 1．21)和木糖醇脱氢酶(XDH)(EC 还原酶(XR)(EC 糖醇进入代谢途径的前两步中的酶。对瑞氏木霉这两个酶基因的克隆和研究， 为进一步研究72reesei木糖代谢酶基因的表达与调控以及进一步的菌株改造奠 定了基础。木糖酵作为非糖植物甜分有多方面的生理作用，其市场应用潜力巨 大。构建瑞氏木霉木糖醇生产菌株，采用发酵法直接利用天然半纤维素生产木 糖醇，与化学法相比具有成本低、无污染等多种优点。广k 本文采用PCR技术，以瑞氏木霉染色体DNA为模板扩增了编码木糖醇 脱氢酶的基因组基因。懈PCR扩增产物分离纯化后，用xbaI和SacI双酶切， 与被同样双酶切的载体pECl9连接。用连接产物转化E．co／／DH5o，在氨苄 青霉素(Amp)平板上筛选得到阳性转化子。采用双脱氧链末端终止法对插入 的外源DNA片段进行序列测定，测定结果证实插入片段确实为编码瑞氏木霉 木糖醇脱氢酶的基因组基因。将此重组质粒命名为pUCl9．．xdh。与瑞氏木霉 XDH cDNA序列相比，基因组序列中含有一个118bp的典型内含子。该基因 最可能的读码框架编码363个氨基酸，理论计算分子量为38，399Da。通过国 酸序列进行了同源性比较。比较结果显示，瑞氏木霉的木糖醇脱氢酶与来源于 Galactocanc打da hh7 mastotermitis和Pk sf咖f，括的同种酶有高的序列同源性，分 别达73％：}11 65％。对氨基酸序列的活性位点分析和同源性比较均表明瑞氏术露 的XDH是中等长度链醇脱氢酶家族的一员。基于氨基酸序列同源性对瑞氏_术 瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的克隆和性质分析 以及基因的移码突变 霉XDH的三维空间结构进行了同源模建d 对携带有质粒pAJ401一xdhl的重组酿酒酵母HXl进行了液体培养。峙养 物经细胞破碲、硫酸铵沉淀和离子交换柱层析后，初步分离纯化了由重组酿酒 酵母所产生的来源于瑞氏木霉的木糖醇脱氢酶，并测定了该酶在多种底物上的 催化专一性。测定结果显示该酶蛋白的主要催化活力为木糖醇脱氢酶活力。二L 为使瑞氏木霉的XDH基因失活，达到积累木糖醇的目的，我们对XDH 基因进行了体外移码突变。蛹Xhol单酶切携带有XDH基因组基因的重组质 段的3’突出末端，然后在T。DNA连接酶作用下进行自身连接反应。用连接 反应物转化EcoilDH5 o，在Amp平板上随机挑选具Amp抗性的转化子并进 行测序验证。将测序结果证实XDH基因序列确已发生移码突变的转化子质粒 命名为pAJ401．xm。用丝状真菌溶壁酶LysingEnzymes制备瑞氏木霉原生质 体，在聚乙二醇(PEG)、山梨醇和氯化钙的作用下，将质粒pAJ401．xm和 pAN7一l(带有潮霉素B抗性基因)对瑞氏木霉原生质体进行共转化。将转化液 涂布在含潮霉素B的选择性再生平板上，筛选具潮霉素B抗性的阳性转化子。 从中进一步挑选通过基因定位置换整合使瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因失活，因 而木糖醇得以积累的菌株。此部分工作正在进行中。遗 瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的基因克隆、序列测定和序列分析，以及对 XDH酶学性质的研究，在国内外均属首次报道。本研究内容对于从分子水平 上了解瑞氏木霉木糖代谢关键酶的基因表达调控机理，对于丝状真菌分子生物 学