视网膜特异性真核表达载体PcDNA3.1-%27%2b--Rho-VEGF的构建、体外表达及Rho-VEGF转基因鼠的初步建立.pdfVIP

ILRho-VEGF 视刚膜特异性真核表达裁体PcDNA3 的构建、体外表达及Rho．VEGF转基叫鼠的初步建直 中文摘要 Rho．VEGF转基因鼠的初步建立 硕士研究生：吕秀兰 导 师： 吕林教授 中山大学中山眼科中心 摘要 糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)的基本病理过程是微循环障碍， 视网膜组织缺血缺氧，最终形成视网膜新生血管“’。新生血管的发生机制以及如 何控制新生血管的形成，已成为目前糖尿病视网膜病变治疗中最为棘手的问题， 也是影响预后的关键。 endothelialfactor 血管内皮生长因子(Vascular growthVEGF)在糖尿病视网 膜病变的发生发展过程中起到了极其重要的作用，但外源性的VEGF很难产生 视网膜新生血管。目前采用动物模型进行VEGF实验研究主要有三种方法：1． 外源性VEGF注射(如玻璃体腔反复注射等)。’。但外源性注射不可避免地会产 PDGF)、 factor 生外伤和炎症，使得色素源性生长因子(pigmentepithelium．derived basicfibroblast 成纤维细胞生长因子(bFGF factor)、转移生长因子 growth factor．beta (transforminggrowth TGF—beta)等多种生长因子同时参与作用； 2．VEGF缓释装置的应用o’。将VEGF做成持续性释放的小丸放入大鼠的玻璃体 腔或视网膜下，但有的动物模型显示，并不能刺激视网膜新生血管的形成，或只 能形成暂时性的视网膜新生血管。3．VEGF的视网膜内源性表达“’。即建立视网 膜特异性表达的VEGF转基因鼠模型。该转基因鼠具有如下优点：VEGF诱导的 视网膜新生血管近局限于视网膜而不出现在脉络膜；产生的视网膜新生血管持续 时间长达4个月以上，从而易于进行相关的药物研究。该动物模型给视网膜新生 』(|_L管的防治研究开辟了一个新领域。 本文进行了以下三方面的研究： 1、 构建视网膜特异性真核表达载体PcDNA3．1+-Rho．vEGF。 方法：常规法提取Blab／c小鼠基因组DNA，根据文献报道，设计引物，扩增 1-Rho·VEGF 视网膜特异性真核表i占载体PcDNA3 的构建、体外表达及Rho．VEGF转基冈鼠的初步建立 中文摘要 酶切的Rho基因连接。利用酶切，PCR以及测序对重组质粒进行鉴定。 结果：视网膜特异性启动子Rho基因全长为714bp。VEGF基因全长约为 和NheI酶双酶切后得到的两条带，长度分别约为714bp和6．0Kb，以重组质粒 与以基因组为模板扩增得到的Rho启动子序列片段大小相等，以质粒pcDNA3．1 +为模板和空白对照无该扩增条带。测序结果与GenBank中相应序列对照，发现 所构建Rho启动子基因于GenBank报告的序列一致。 体构建成功。 细胞)，研究重组质粒在人视网膜色素上皮细胞的特异性表达 方法：体外培养人视网膜色素上皮细胞(D407细胞)、脐静脉内皮细胞 方法检测转染有无成功。观察转染前后细胞形态的变化以及细胞生长曲线的改 1+ ．VEG