志贺氏菌属弗氏2a染色体基因文库的构建1).pdfVIP

遗 传 学 报， 1.4(4);313-317,1987 Acta Geraeticz Sintca 志贺氏菌属弗氏2a染色体基因文库的构建’‘ 苏国富徐永强张兆山陈添弥黄翠芬 军（事医学科学院基础医学研究所，北京） 以A噬菌体 EMBL3作载体，用体外包装技术构建了志贺氏菌属弗氏2a染色体基因文 库。该体外包装系统的包装效率达1.6X108PftuflagDNA，重组噬菌体的产量达2X106Pfu/ a;gDNA。对重组噬菌体进行了遗传分析，即分别对 7个标记 l（eulpro3his,,arg,t,hr,,purl etroA）作了侧定。测得当噬菌体母液的效价为8.7X10Pfufml时，带有以上标记的重组噬 菌体的效价为5X104-8.2X10spfufm,J。这个令人满意的结果为尔后克隆志贺氏菌属弗氏 2a染色体上的与群抗原3,4和型抗原 11有关的基因打下了基础。 关键词：志贺氏菌属弗氏2a;1.载体 EMBL3;基因文库 传染性腹泻是我国除传染性肝炎以外的第二种常见病、多发病。志贺氏菌属是引起 传染性腹泻的主要病原体。在发达国家，主要由宋内氏痢疾杆菌致病；在发展中国家，则 以弗氏痢疾杆菌为主；在我国，弗氏2a是引起痢疾的主要病原体。最近 Formal等的研 究表明JI〔，弗氏2a包含一个分子量为140kb的大质粒，它与弗氏2a侵袭肠上皮细胞的能 力有关。法国巴斯德研究所的学者们去年已将与侵袭有关的基因克隆至 coosmm-id载体41〔0 SansonettiE$j证明编码群抗原3,4的基因与 his基因连锁，表达型抗原 II的基囚与pro基 因共转移。 已有试验证明作为预防弗氏2a感染的口服活菌苗必须具有侵袭基因和弗氏 }a染色体上的his基因区和 pro基因区[f1［。我们为了从弗氏2a染色体克隆表达群抗原 3,4和型抗原 II的基因，以x噬菌体 EMBL3作载体，用体外包装技术构建了弗氏2a的 染色体基因文库，获得了满意的结果。 材 料 和 方 法 一（）细菌M株 大肠杆ffiqNM538(supFhsdR),NM539[supFhsdR(P,coX3)I, AB1157(thrlcuprohisarg),W3110汁ur1)和 RW1229(aroAprohis),,志贺氏菌属弗 氏2a株 SF-12。 二（）细菌培养基 丰富培养基为 LB，选择培养基采用M9，但以0.2-1多的甘 油代替葡萄糖 （因葡萄糖能降低噬菌体在细胞表面的吸附位点）。在 M，培养基中，维生 素 B1、硫酸亚铁和各种氨基酸的浓度均为2SA(g/mlfl固体培养基琼脂的浓度为 1.2%，半 固体琼脂的浓度为0.6%fl 三（）DNA.限制性内切酶和化学试剂 ‘载体 DNAEMBL3,野生型XDNA 和z经 HindIII消化后的分子量标准，限制性内切酶 Sau3A,Baml-11.,EcoRl,T40NA 本文于 1986年8月6Q收到。 1)沈阳军V-兽医研究所侯贵盛同志参加部分工作。 314 遗 传 学 报 14卷 连接酶和包装抽提物均为 PromegaBiotec产品，琼脂糖 (Sera)，其余化学试剂均为国 内产品 分（析纯）。 （四）从志贺氏菌属弗氏2a株 SF-12抽提染色体 DNA 依文献[71Q 五（）限制性内切酶酶解 DNA 按厂家推荐的条件。 六（）插人DNA 弗氏2a染色体 DNA）的部分酶解 依文献[3]a 七（）从琼脂糖凝胶回收DNA片段 先从琼脂糖凝胶中切取包含10-20kbDNA 片段的凝胶块，捣碎后加入等体积的饱和酚，轻轻混匀，置干冰10分钟，立即6,000rpm 4℃离心15分钟。吸取上层水相，用酚和氯仿各抽提1次，乙醇沉淀，再以70外乙醇洗 1次，干燥后溶于 1mM Tris(pH8.0)-0.1rnM EDTA 中。也可用电泳洗脱法从凝胶中回 收 DNA片段气〔 八（）连接反应 载体 DNA与插入 DNA的最佳比例为3:.1。载体 DNA和插 人 DNA在反应液中的浓度分别为0.1/cg/川和