质粒DNA的构型变化对转录的调控作用1).pdfVIP

遗 传 学报，14(1);8-11,1987 AcfaGereeficaSinica 质粒DNA的构型变化对转录的调控作用” 王 斌 （中国科学院遗传研究所，北京） 本文以重组质粒pZrns51DNA为转录模板，在无细胞离体转录系统中研究了质粒DNA 的构型变化与其模板活性的关系。结果表明：(1)质粒DNA的构型变化对其模板活性有明 显影响；(2）超螺旋化对于质粒DNA在转录水平上的表达是必需的。 这些结果对于离体转 录的研究有其生物学意义。 前面我们已报道了和玉米细胞质雄性不育 c（ms）有关的线粒体DNA(mtDNA）的 克隆和离体表达[1,［2,10,117。我们知道，制备的质粒DNA有3种可能的构型，即T,II,III 型31〔0。1型为超螺旋结构，II型为开环结构，III型为线状结构。 在细菌和病毒中已有报 道，DNA的构型变化，尤其是超螺旋化，对于DNA的模板活性有明显影响[4,67。当用重组 质粒DNA作为模板进行离体转录时，质粒 DNA的构型变化对它在转录水平上的表达 有什么影响？ 为了回答这个问题，我们用重组质粒pZmS51DNA为转录模板，用玉米 RNA聚合酶B为转录酶，在无细胞离体转录系统中研究了质粒DNA的构型变化和其模 板活性之间的关系。 才才料 和 方 法 一（）模板DNA 按照 Pring[9，等人介绍的方法，从黑暗培养6天的S型cms玉米芽中提取mtDNA, 将总的mtDNA在 1务的琼脂糖凝胶中电泳，将S-2DNA的条带切出，电泳洗脱、酒精沉 淀后溶于TE缓冲液中。将等量的经过PSII酶切过的S-2D:1A和pBR322DNA混合，并 与T4DNA连接酶一起保温，再用这种处理过的混合DNA转化经CaCI：处理后尚处于感 受态的E.．cclaHB101。扩大培养后涂布在含有Tc(四环素)15,ccg/ml的LB固体培养基上， 挑出Tc`转化体。再将这些转化体转接到含Ap氨节青霉素）50fcg/ml和Tc15/zg/ml的 LB固体培养基上，再挑选出ApSTcr的转化体。对这些转化体 A（pTcr)进行菌落杂交31〔 和质粒DNA限制性内切酶图谱分析，证明其中一个转化体pZmS51含有S-2DNA5末‘ 端2,155by长的一个PsiI酶切片段。 按照Clewell的方法从pZmS51提取质粒DNA。新制备的DNA制品主要是I型 DNA；将这种DNA经过光照处理即可得到II型DNA，光照时间越长，则II型DNA的 比例就越高；如将新制备的DNA制品经过对插人顺序没有切点对载体部分只有 I个切点 的SalI完全酶解，即可得到III型DNAo 本文于 1986年3月18H收到。 1)Dr.R.J.Mans惠pi实验材料，杨涛兰协助进行电镜观察，梁玉梅帮助进行凝胶扫描，特此致谢。 I期 王 斌：质粒，DNA 的构型变化对转录的调控作用 9 二（）玉米RNA聚合酶i的制备和活性测定 按照文献 [21的方法制备玉米RNA聚合酶B,其比活性为5.5单位 在（每分钟内，对 a-鹅膏覃碱敏感的32p-UMp掺人量为1nmole时的酶量就规定为1个酶活单位），这种酶 是高度纯化的在不变性条件下聚丙烯酞胺凝电泳图谱中只呈现I条均一的带。玉米RNA 聚合酶B的活性测定方法是按文献 【1]进行的。 结 果 一（）模板DNA 实验中所用的不同构型的模板DNA都是从重组质粒pZmS51制备的。pZmS51质 粒的结构如图1所示，它是在pBR322中插入了一个2,155by长的S-2DNA片段。 实验中共测定了3种构型不同的pZmS51DNA 的模板活性。 DNA制品A是按照 Clewell的方法从 pZmS51中新制备的质粒DNA，它主要是 I型DNA 图（2,A);DNA制品B是将A经过光照处理后得到的 I型和II型DNA 的混合物 （图2,B);DNA制品C 是将A经过SalI完全酶解后得到的，它全部都是III 型DNA （图2，C)o 根据图2凝胶扫描图谱中各个峰值的大小计算 出： 在DNA制品