一个改进的PCR过程中聚合酶复制精确性测定系统的建立.pdfVIP

遗传学报，24(2).183192,1997 Aeta6如e它aSi威视。 一个改进的PCR过程中聚合酶复制 精确性测定系统的建立 杜汉森 徐 迈 季朝能 张 洁 毛裕民 复（旦大学遗传学研究所 ＿r.海 200433) 摘要 在大肠杆菌中建立了一套用于测定DNA聚合酶在PCR过程中复制精确性的系统， 并测定了耐热FDDNA聚合酶在PCR扩增过程中的复制精确性。这一系统主要包括以质 粒pUC118和PUCI19为出发质粒所构建的一套共6个突变质粒，分别为pFDFPl18和 pFDFP119(+1移码突变）、pFDFM118和pFDFM119冬1移码突变）、pFDFU118和pFDFU119 碱（基置换突变）。这些突变质粒均不能进行lacZ--：互补反应，因此在含有X-Gal和IPTG 的培养基上菌落呈 自色。同时还 构建 了 PCR产物 克隆载体 pFDFL118和 pFDFLI19。以上述突变质粒为模板进行PCR反应，取反应产物和pFDFL118或pFDFLI19 连接后转化到大肠杆菌中。若在PCR过程中发生回复突变，则转化子在含有X-Gal和 IPTG的培养基上呈蓝色。由转化子中蓝白菌落个数即可计算出DNA聚合酶的复制差错 率。用这一系统测得FDDNA耐热聚合酶的复制差错率为10”一10-6. 关键词 PCR,DNA聚合酶，复制精确性，碱基置换突变，移码突变 FDDNA耐热聚合酶是从栖热杆菌FD3009(Thermussp.FD3009）中得来的酶，它 的多种生化特性与TaqDNA耐热聚合酶相似2[1，且已成功地应用于PCR中用来进行性 别鉴定1,【61、地中海贫血病的检测[3,4]、进化和分类学研究[s]［等。为了提高该酶的应用价值 并扩大它的应用范围，有必要测定它的复制精确性，为此构建了一套用来检测PCR 中复制精确性的系统。并用它测定了FDDNA聚合酶在PCR过程中的复制精确 性。 有关PCR过程中DNA聚合酶复制精确性的测定目前已有多种方法9[131，主要的 有：(a)变性梯度胶电泳法19h(b）化学基团修饰法[121;(c)lacZ-：表达法。前2种方法因为 灵敏度不高和操作繁琐的缺点而限制了它们的广泛应用。Kunkef]首先建立了lacZoc 表达法，但他用的是缺口DNA(gappedDNA)合成法，所测定的是一轮DNA复制的精 确性。Barnes7[1根据Kunkel的原理测定了整个PCR过程中的复制精确性。但他们测定 的对象都是正向突变对lacZ--，互补的影响，具体地讲是根据X-Gal培养基上蓝色菌 落中出现的白色菌落来计算差错率。但是白色菌落的出现不一定是突变的结果，菌落分 布过密或培养时间不够都会出现白色菌落。反之，由于遗传密码的兼并性，蓝色菌落中 可能包含了突变的菌落。此外，正向突变究竟是碱基置换突变或移码突变必须经过核昔 国家 8“63高科技发展计划生物技术领域资助项目。本文」二1994-12-07收到，1946-09-18修回 184 遗 传 学 报 24卷 酸测序才知道。为了解决这些问题，我们构建了一套PCR过程中DNA聚合酶复制精 确性的遗传学测定系统，从PUC118和PUC119出发，构建包括碱基置换突变和移码突 变在内的3对突变质粒，以它们为模板进行PCR扩增，通过白色菌落中间出现的蓝色 菌落的计数来测定PCR过程中DNA聚合酶的复制精确性。整个系统还包括两个由 PUC118和PUCI19衍生的用于克隆PCR产物的载体质粒，在这两个载体质粒中各用一 段较长的无关DNA片段置换PUC118和PUC119质粒上IacZ-，基因片段5端的一部 分序列，这样就可以避免因质粒自连而在克隆子中混人少量的PUC118或PUC119质粒 所带来的假阳性结果。 1 材料和方法 1.1材料 大肠杆菌TG1(SupEF0[traD36proABIacIqlacZAM15],mMV1184(P [traD36proAB十lacIqlacZ△M154p、质粒PUC118和PUC119、辅助噬菌体M13KO7均 为本实验室保存。各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、T4DNA聚合酶、T4DNA 多核昔酸激酶、Klenow大片段、MungBean核酸酶、Exonux