脓肿分枝杆菌RNA聚合酶的分离纯化和活性研究.pdfVIP

免一AMM亚单位疫苗加强免疫可以诱导产生较强的细胞免疫和体液免疫反应。从脾细胞分泌 IFN—Y的水平测定的结果中可以看到，BCG初免一AMM亚单位疫苗加强免疫两次的实验组分泌 疫苗加强免疫一次和BCG组的差异不显著。从体液免疫检测中，我们发现BCG初免一AMM亚单位 单位疫苗加强一次和加强两次，并且加强次数越多，该比值越低。亚单位疫苗加强免疫同时也促 强免疫策略也会抑fl；lJThl型细胞免疫反应，促使免疫应答向Th2型转化，这也和抗体类型特征相一 T 致，提示亚单位疫苗不宜多次反复加强。此外，AMM亚单位疫苗强化免疫一次可有效活化CD8 细胞，克服了单用BCG疫苗的不足。 结核分枝杆菌感染人体后多寄生于巨噬细胞内，因此要求结核疫苗必须能够诱导较强的细 胞免疫反应。能够分泌IFN—y的特异性T淋巴细胞对机体抗结核分枝杆菌起重要免疫保护作用。 的T细胞，是机体抗结核分枝杆菌感染的主要免疫反应。Th2免疫反应被认为与结核免疫病理有 型免疫反应向Th2型转化。CD8+T细胞可在早期识别被结核分枝杆菌感染的靶细胞并杀死细胞内 病原体，是BCG接种起免疫保护效应的主要细胞。结核亚单位疫苗加强免疫策略的重点是促进疫 苗激活Thl为主的细胞免疫反应和CD81细胞。 亚单位疫苗可以不受机体已被分枝杆菌刺激的影响，有效诱导免疫反应，增强机体的免疫 力。目前，正在研究的亚单位疫苗包括蛋白质多肽、DNA疫苗、以病毒为载体的疫苗等，不同的 亚单位疫苗通过有效诱导T细胞免疫反应从而建立对结核分枝杆菌的免疫力我们用BCG重要的保 免疫2次，可以有效刺激激活免疫记忆细胞，产生以细胞免疫为主的免疫反应。我们的研究发现 AMM亚单位疫苗加强免疫可促使免疫反应向Th2型转化。因此，并不是加强免疫次数越多越好。 结核疫苗免疫策略是一个复杂的问题，我们既要诱导机体对结核分枝杆菌保持一个较高的 免疫水平，同时也要考虑到过强的免疫应答及不同的免疫类型会造成机体组织器官的免疫病理损 伤，反而不利于保护患者。目前对结核疫苗尚缺乏有效的能准确反应保护力的免疫反应指标，综 合评价各项免疫指标，制定安全、有效的BCG初免．亚单位疫苗加强免疫策略仍然是一个复杂的问 题，值得进一步研究。 脓肿分枝杆菌RNA聚合酶的分离纯化和活性研究 上海市肺科医院结核科200433沙巍肖和平何国钧 上海市华山医院传染科翁心华 细菌的RNA聚合酶是由核心酶和O因子组成，前者包含了4个亚基一Q：1313’，其中13亚基是 我们的研究已证实对RFP耐药的脓肿分枝杆菌 利福平(RFP)作用的靶蛋白，其编码基因为rpoB。 327 菌株的rpoB基因未出现突变，但13亚基只是细菌RNA聚合酶5个亚基中的一个，有学者认为，在 rpoB基因未发生突变的菌株，可能还存在着由于RNA聚合酶的其他亚基的突变导致了13亚基利福 平结合部位构型的改变，从而导致细菌耐药的机制。因此观察RFP是否对分枝杆菌RNA聚合酶的 功能有抑制作用，可以在蛋白质水平直接检测细菌的靶蛋白是否对此药物敏感，从而为临床上治 疗分枝杆菌感染时选择有效的化疗药物提供理论基础。在本文中，我们对脓肿分枝杆菌标准株与 临床敏感株的RNA聚合酶进行了分离纯化，对其在体外的转录功能进行了研究，并观察了不同浓 度利福平对其功能的抑制作用。 材料和方法 一、菌株 供；，一株脓肿分枝杆菌临床敏感株(MIC为4 ug／n[11)由上海市肺科医院检验科分离鉴定。 二、方法： 1．RNA聚合酶的分离纯化 Tris—C1 PH7．9，5％丙三醇，0．1mMEDTA，0．1mMDTT，其中DTT在使用前加入)缓冲液，超声 破菌。 PEI，Sigma 用60％饱和的硫酸铵沉淀，沉淀用TGED缓冲液重新溶解，此为含RNA聚合酶的初分离物。 液连续梯度洗脱，收集峰值蛋白； 4)分离蛋白盐析和超滤：将收集的蛋白用80％饱和度的硫酸铵沉淀，用TGED缓冲液重溶 泳，观察所