携改良型HBVpre-SI基因表达载体的构建及相关研究.pdfVIP

㈨IIIII[IIIIIIIllIIII[卜 {Y1889019 携改良型HBVpre．S1基因表达载体的构建及相关研究 摘 要 目的：肝脏疾病是世界性的常见疾病，现有的治疗方法却不理想，基 因治疗将可能是治疗最为有效方法。然而，目前肝病的基因治疗进展缓慢， 其中最主要的原因是缺乏高效的、肝细胞特异性的载体。因此，研制出高效 的嗜肝性基因治疗载体，是肝病基因治疗取得实质进展的关键。pre．S1蛋白 的免疫介导部位，肝细胞、B细胞和T细胞均可表达针对这一肽段的受体， 变异的病毒只要这一区段完好就有传染性。本研究采用基因重组技术，将 HBV表面蛋白中嗜肝性成分的基因编码作无免疫原性修改后，构建出携改 点突变延伸的方法，通过两个独立的PCR扩增反应，将预设的突变构建在 重叠区域，同时存在于两个扩增片段中，混合得到的两个重叠DNA片段， 用两条分别与两个原始片段末端结合的引物进行第二次PCR扩增，将硬性 较强的脯氨酸用柔性较大的丙氨酸替换，完成HBVpre．S1基因的突变。将突 中，在酚／氯仿抽提纯化，将重组质粒测序后，用醋酸锂法转化酵母细胞 提取酵母蛋白质，按常规方法分析表达产物并进行十二烷基磺酸钠一聚丙 l 析显示扩增片段约357bp，基因测序结果显示序列完全正确，与预期片段符 合，且无非特异扩增现象。通过片段重叠延伸法，成功将硬性较强的脯氨 酸替换成柔性较大的丙氨酸，完成HBVpre．S1基因的突变。分别用限制性核 1构建成功。用醋 上，经酶切鉴定结果正确，重组质粒pGBKT7．HBVpre．S 酸锂法转化酵母后在SD／Trp培养基上筛选生长。培养数天后，挑取一菌 落进行PCR扩增HBVpre．S1蛋白基因，结果显示转化成功。提取未转化质 粒与转化后质粒的酵母蛋白质，进行SDS．PAGE和Westem免疫印迹分析， 体外定点突变，对位点CCC成功进行定点突变至ljgcc，三次PCR反应后在 AHl09，在SD／Trp培养基上转化成功。 关键词：riBVpre．S1；基因突变；真核表达载体；酵母细胞 l vector HBVpre-Sgeneexpression Bringimproved Construcfionandcorrelation diseaseisacommondiseaseinthe Abstract：Objective：Liver world， treatment． treatmentsarenot isthemosteffective 。existing ideal，genetherapy currentslow in ofliver which However，the progressgenetherapy disease，of islackof carder．The themost reason efficient，liver important cell—specific andefficient