荧光分析法35174.pptVIP

外部能量转换 （external conversion)：激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而失去能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 体系间跨越(intersystem crossing)：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程；分子由激发单重态跨越到激发三重态。 荧光熄灭法: 荧光物质加入某些猝灭剂后，其荧 光强度的减少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，可用于测定猝灭剂的含量，这种方法称为荧光熄灭法。 5.散射光 瑞利光：光子与物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交换，运动方向改变；λ瑞利光＝λ入射光 拉曼光：光子与物质分子发生非弹性碰撞，发生 能量交换，运动方向改变；λ拉曼光≠λ入射光 320 360 448 激发 320nm 硫酸奎宁 350 448 激发 350nm 硫酸奎宁 320 360 激发 320nm 0.1mol/L硫酸 350 400 激发 350nm 0.1mol/L硫酸 a.强度 b.强度 硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光（a）与拉曼光谱（b） 271 350 416 469 511 267 344 409 459 500 267 344 408 458 499 — 320 375 418 450 — 346 410 461 502 水 乙 醇 环己烷 CCl4 CHCl3 248 313 365 405 436 激发光(nm) 溶剂 在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长(nm) 第二节 荧光定量分析方法 一、荧光强度与物质浓度的关系 I0 I F (荧光定量分析法的依据) 结论：荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀的溶液(A0.05)。对于较浓溶液，会产生自熄灭现象。 二、定量分析方法 优点 1.灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：0.1～0.001?g/mL 2.选择性强 既可依据发射光谱特征，又可根据激发光谱特征； 3.试样量少和方法简单 缺点 应用范围小 1.校正曲线法 C F 校正曲线 CX FX 步骤： 1.配制不同浓度的标准 溶液 2.做F～C关系曲线 3.求得浓度 注意：固定仪器和测定条件； 试样浓度在线性范围内 2.比例法 注意：样品与标样溶液浓度接近，在线性范围内 步骤： 1.配制标准溶液和试样溶液 2.测F 3.求浓度 3.联立方程式法 两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定 分别在各自的?荧波长处测定,求出它们的含量 两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱有显著区 别,在某一激发光下一个组分产生荧光峰,另一组分不产生荧光;选用不同的激发光进行测定 如果两组分的荧光光谱和激发光谱相互干扰 利用荧光强度的加和性（F=F1+F2+F3+ ），在适宜的荧光波长处测定，用联立方程来求解 第三节 荧光分光光度计和其他荧光分析技术 用于测量荧光强度的仪器有： 1.滤光片荧光计 2.滤光片－单色器荧光计 3.荧光分光光度计 一、荧光分光光度计 1.荧光分光光度计的主要部件：光源、激发单色器、发射单色器、样品池、检测系统 光源 激发单色器 样品池 发射单色器 检测器 放大器 指示器· 记录器 SK-2003A型荧光光谱仪(国内首创） RF-5400荧光光度计 Hitachi(日立)F-2500荧光分光光度 荧光分光光度计澳大利亚 2.仪器的校正 灵敏度的校正 在选定波长及狭缝宽度的条件下，用一种稳定的荧光物质，配成浓度一致的对照品对仪器进行校正，使每次测得的荧光强度调节到相同数值（50％或100％）。 波长校正 汞灯的标准谱线对单色器波长刻度校正。 激发光谱和荧光光谱的校正 1.单光束荧光光度计，可用仪器上附有的校正装置将每一波长的光源强度调整到一致，然后以表观光谱上每一波长的强度除以检测器对每一波长的感应强度进行校正。 2.双光束荧光光度计，可用参比光束抵消光学误差。 二、其他荧光分析技术简介 1.激光荧光分析 特点：激光作光源，一个单色器，用于分析超低浓度物质。 2.时间分辨荧光分析 特点：利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检测之间延缓的时间不同，实现分别检测的目的。 3.同步荧光分析 特点:选择适宜的?λ,同时扫描激发波长和发射波长，得到同步荧光光谱；减少光谱重叠，提高分辨率；用于定量分析。 4.胶束增敏荧光分析 特点：采用化学方法