凡纳滨对虾及养殖水体中弧菌的分离鉴定.pdfVIP

江苏农业科学 2013年第41卷第6期 何苹萍，赵永贞，陈秀荔，等．凡纳滨对虾及养殖水体中弧菌的分离鉴定[J]．江苏农业科学，2013，41(6)：199—202 凡纳滨对虾及养殖水体中弧菌的分离鉴定 何苹萍，赵永贞，陈秀荔，张 彬，黄 婷，彭 敏，杨眷玲，杨彦豪，李咏梅 ，陈晓汉 (广西壮族 自治区水产研究所，广西南宁530021) 摘要：采用TCBS选择培养基从广西钦州市、防城港市等地的凡纳滨对虾及养殖水体 中分离纯化得到8株细菌， 对分离菌株进行生理生化特性鉴定，并对全部菌株 16SrRNA基因序列及部分菌株的HSP60基因序列进行克隆、测 序 ，运用Mega4．1软件中的Neighbor—Joining法构建系统进化树。选取河流弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌各 1株对凡纳 滨对虾成虾进行人工感染试验。结果表明，菌株s被鉴定为河流弧菌，菌株M1、M2、M3、水 1、水 2、水3被鉴定为溶藻 弧菌、菌株H1被鉴定为哈氏弧菌；溶藻弧菌对对虾成虾的致病性最强，其次是哈氏弧菌。 关键词：凡纳滨对虾 ；弧菌；分离鉴定 ；致病性 中图分类号：$945．49 文献标志码 ：A 文章编号：1002—1302(2013)06—0199—03 弧菌病主要是由弧菌属细菌引起的一类细菌性疾病，发 生理盐水清洗数次，转入无菌EP管中匀浆，6000r／min离心 病率高、危害大，是海水养殖动物病害研究的主要领域之一。 1min后取上清，将不同稀释倍数的上清液涂布于TCBS培养 弧菌是一种条件致病菌，很多研究表明，弧菌引起对虾发病与 基，置32℃下培养 l6—24h后取出观察菌落。将培养 出的 养殖环境中的弧菌数量有关 j。在对虾育苗期 由于弧菌病 细菌进行纯化，再挑单个菌落接种到TSB培养基，部分菌液 导致幼体特别是状 Ⅱ期及其后期的幼体大量死亡。已报道的 置于4oC冰箱保存备用，部分菌液加20％甘油冻存于一80℃ 相关病原主要包括哈氏弧菌 ( harveyi)、溶藻弧菌 ( 冰箱。 alginolytm)、副溶血弧菌 (Vibrioparahaemolyticus)等 。 1．2．2 成虾 无菌操作，从成虾肝胰腺取样划线接种于 本研究对广西北部湾地区凡纳滨对虾及养殖水体中的弧菌进 TCBS培养基，或取成虾鳃丝于无菌EP管中匀浆。后续步骤 行分离鉴定，旨在了解弧菌分布情况及其致病性，为凡纳滨对 参考 “1．2．1”节。 虾的健康养殖提供基础资料，为调节和改善对虾养殖环境提 1．2．3 养殖水体 将养殖水体接种于无菌 TSB中培养 供理论参考。 16h，将菌液稀释一定倍数后涂布于TCBS培养基，或直接将 养殖水体涂布于TCBS培养基上。后续步骤参考 “1．2．1”节。 1 材料与方法 1．3 细菌的生化鉴定 1．1 材料 利用弧菌科微量生化鉴定管对分离纯化的细菌进行生化 人工感染试验所用虾来源于广西防城港市企沙镇广西水 特性鉴定，包括嗜盐性、糖发酵试验等。 产研究所凡纳滨对虾 良种场；TCBS、TSB培养基购 自北京路 1．4 16SrRNA序列的扩增、克隆测序 桥公司；弧菌科微量生化鉴定管购 自杭州天和微生物试剂有 1．4．1 细菌模板DNA的制备 运用细菌DNA提取试剂盒 限公司；2×TaqPCRMastermix、细菌DNA提取试剂盒、离心 提取菌液中细菌的DNA。 柱型普通琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒、TACloning试剂盒、 1．4．2 16SrRNA的扩增 以16SrRNA为靶序列的PCR反 DH5a感受态细胞购 自北京天根生物公司；16SrRNA1： 应条件 ：94℃预变性5min；94℃变性50S，55℃退火50s， 5 一AGAGTITGATCCTGGCTCAG一3 ，16S rRNA2：5 一