一种广泛适用的RNA提取方法.pdfVIP

一种广泛适用的RNA 提取方法1 淳俊，郑彦峰，王胜华*，陈放 四川大学生命科学学院，成都（610064 ） E-mail：shwang200@ 摘 要：分离提取高质量的RNA 是基因表达、调控与基因工程等研究的基础，而RNase ， 多糖及多酚类物质严重干扰RNA 的分离提取过程.本文利用硅藻土对RNase 的吸附性，结合 PVP ，高盐及乙二醇丁醚沉淀等处理，建立了一种广泛适用的RNA 提取方法．在富含多糖 的玉米胚乳，富含RNase 的动物肝脏，多酚多油脂的银杏、麻疯树以及木霉、酵母等10 多 种RNA 提取困难的动、植物与微生物材料都提取出完整性好，得率高的RNA；RT-PCR 实 验表明提取的RNA 能够用于后续的分子生物学研究．此外，将分离提取的总RNA 经过LiCl 与PEG8000 加NaCl 沉淀步骤有效地去除了大片段RNA；经水稻osa-mir-156 做成熟miRNA 的 RT-PCR 验证，富集得到的小RNA 可以用于miRNA 克隆等后续实验． 关键词：硅藻土，RNA 提取，小RNA ，乙二醇丁醚 中图分类号：Q781 1．引言 获得完整性良好的RNA 一直都是致力于基因表达调控研究的分子生物学者面对的挑战 ， ， 性课题．尽管已经建立起了许多RNA 的分离提取方法[1 2 3]并开发出若干RNA 的分离提取 试盒．但是，RNA 酶、多糖、多酚等物质或者降解RNA ，或者与RNA 形成难溶物等方式 ， ， 严重干扰RNA 的提取[4 5 6] ，还是常常导致实验的失败．本文利用硅藻土能够有效吸附RNA [7，8] 酶 的特性，结合高盐，PVP 及乙二醇丁醚沉淀等过程，建立了高效高质量RNA 提取方 法，并通过动物肝脏，灌浆期玉米胚乳，银杏叶片等中药材以及木霉等微生物材料证明其具 有适应性广、经济高效的特点． 另一方面，小RNA 是基因表达调控的重要分子，在调控基因表达的基础理论研究以及 基因工程，基因治疗等方面极具潜力，已经成为国内外的研究热点[9,10,11] ．因而，我们在分 离出的总RNA 的基础上进一步富集了小RNA ．实验证明，富集的小RNA 能够用于后续的 研究工作． 2 ．材料和方法 2.1 实验材料 植物：富含多酚的麻疯树幼叶、蓖麻树幼叶、乌桕树幼叶、银杏树幼叶、芦荟叶片，富 含多糖的灌浆期玉米胚乳，水稻幼苗，以及油脂丰富的麻疯树种子． 动物：富含RNase 的家兔肝脏． 微生物：木霉、酵母． 2.2 主要仪器 冷冻离心机：Centrifuge 5804 R （eppenderf 公司） 电泳仪：DYY-III 1 型稳压仪（北京六一仪器厂） 紫外凝胶成像系统：Bio IMAGING SYSTEM （SYNGENE ） 紫外可见分光光度计：TU-1800 （北京普析通用仪器有限责任公司） 1本课题得到国家自然科学基金（编号和四川大学科研启动基金资助项目的资助。 - 1 - PCR 仪：Biometra 公司生产的personal cycler 2.3 方法 2.3.1 主要试剂 DEPC 、EDTA 购自Amresco 公司，琼脂糖为Sigma 公司产品，硅藻土、水饱和酚(pH4.7)、 氯仿、异戊醇、5mol/L KAc(pH4.8)、75%乙醇、无水乙醇、乙二醇丁醚、SDS、柠檬酸钠、 Tris、HCl 、2-巯基乙醇、水不溶性聚乙烯吡咯烷酮（PVP ）、5mol/L NaCl、8mol/L LiCl、 50% PEG 8000、1mol/L MgCl 等均匀为国产分析纯试剂. 2 2.