人肝癌细胞系HepG2中survivin-3鉴定及其真核载体构建.pdfVIP

人肝癌细胞系HepG2 中survivin-3 鉴定及其真核载体 构建 徐兵，杨来华 丹阳市中医院，江苏丹阳（212300 ） E-mail ：b_xu98@ 摘 要：目的：鉴定肝癌细胞系HepG2 中survivin 异构体（survivin varient，SVV varient ） 并构建其真核表达载体。方法：提取HepG2 细胞总RNA ，根据Gen-Bank 内survivin 3 个异 构体核苷酸序列设计3 条引物对其进行鉴定；设计含有BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点的SVV-3 引物，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR ）扩增SVV-3 完整编码区，扩增产物用BamHI 和Xho I 双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体 pcDNA3.1 中, 序列测定进行鉴定。结果：HepG2 细胞表达SVV-3、1，SVV-3 表达尤为丰富。对SVV-3 克隆测序，与Gen-Bank 报道完全一 致。结论：成功鉴定出HepG2 表达 SVV-3、1，构建了SVV-3 真核表达载体，为后续研究 提供更明确的目标。 关键词：SVV，真核表达载体，HepG2 中图号：Q279 文献标识码：A 肿瘤发生是一个多阶段、多步骤、多基因累计受损的结果。其中肿瘤细胞增值过度且凋 亡不足是其发病的一个重要机制。SVV 是细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein ,IAP)家族中的一员[1]，通过抑制凋亡下游caspase-3、caspase-7 活化抑制肿瘤细胞凋 亡[2,3] [4] [5] [6,7] [8】 [9] 。已经有报道称乳腺癌 、食管癌 、胃癌 、胰腺癌 和结肠癌 表达上扬，临床跟 踪调查发现其表达也预示着不良预后。SVV 转录后有3 个异构体，为了观察其在HepG2 基 因转录后产物，我们对HepG2 中SVV 异构体进行鉴定，使后续研究有更明确目标。 1 材料与方法 1.1 材料 Taq DNA 聚合酶、dNTP、内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ、T4 DNA 连接酶均购于TAKARA 公司；反转录酶试剂盒购于Fementas 公司；RNA 提取试剂盒Trizol 购于Gibco 公司；少量 质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购至OMAGA 公司；HepG2 细胞系、质粒pcDNA3.1 为 四川大学中心实验室惠赠；DNA marker 、感受态细菌DH5α购于北京天根公司；引物均在 上海生物公司合成。 1.2 方法 1.2.1 HepG2 总RNA 提取及反转录合成HepG2 总cDNA HepG2 细胞在DMEM+FBS （100mL/L）、CO2 50 mL/L 的培养箱中培养，待细胞生长到达其总面积的0.9 时，用冷PBS 冲洗细胞三次，按Trizol 试剂盒说明书，提取HepG2 细胞总RNA ，取5uL 用于反转录，余 -80℃保存。按照翻转录试剂盒说明书合成HepG2 总cDNA 。 1.2.2 PCR 扩增相应基因片段 在计算机软件primer 5.0 辅助下自行设计引物，引物起止 部位见Figure 1 ，引物序列及产物长度见Table 1.反应体系均为50uL，含有10×buffer 1uL ， 0.2mmol/L 的dNTP ，各自上下游引物0.2umol/L , Taq 酶2.5u ，反转录产物cDNA 4uL，反 应条件引物A 为94℃预变性2min ,94 ℃变性45s ，退火温度55.4℃，40s ，72℃延伸30s，30 个循环；最后72℃延伸10 分钟。引物B 与A 相同；将引物C 退火温度调为49.1 ℃,余同上； - 1 -