4.实验四RT-PCR(RNA的提取).pptVIP

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2017-09-02 发布于重庆
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4.实验四RT-PCR(RNA的提取).ppt

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* * 实验四 RT-PCR ---RNA的提取一实验目的通过本实验学习RT-PCR的基本原理和方法。了解RNA提取的基本方法。 PCR基本原理： PCR技术在模板DNA、dNTP、Mg2+、合适Buffer等条件下，用耐热的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的反复循环（25?30次）过程，使目的DNA呈指数扩增。 PCR基本过程：（1）DNA模板的热变性将待扩增DNA加热到94 ℃左右，使双链DNA解开成为单链，并游离于反应体系中作为模板。（2）模板与引物的结合（退火或复性）将体系温度降至合适温度，使加入的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。（3）引物延伸将体系温度升到72℃左右，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端，使链延伸，形成两条与模板互补的新链。以上为1次PCR循环（变性、复性和延伸），新链可作为下一循环的模板）影响PCR各个要素（1）模板（2）耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) （3）引物（4）缓冲溶液与Mg2+ （5）dNTP浓度（6）参数: 变性温度与时间：一般选择：94 0C , 30秒退火温度与时间：取决于引物长度、浓度和G+C含量，一般选择:Tm - 5℃ 延伸温度与时间：一般选择： 70℃ ?75℃ 循环次数：取决于模板浓度，一般循环：30次由于RNA的种类来源很多，因而提取制备方法各异，一般有苯酚法，去污剂法和盐酸胍法，本实验采用TRNzol提取法。组织匀浆后用氯仿处理离心，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中，取出水相用异丙醇可沉淀回收RNA。二实验药品动物肝脏组织 TRNzol 氯仿异丙醇 DEPC 乙醇