10牡丹ACS基因片段的克隆及反义植物表达载体构建.pdfVIP

华 北农 学报 ·2010，25(6)：34-37 牡丹ACS基因片段的克隆及反义植物表达载体构建 范丙友 ，高水平 ，刘改秀。，史国安 ，李嘉珏 ，孔祥生 (1河南科技大学 农学院，洛阳市牡丹生物学重点实验室，河南 洛 阳 4710031；2．河南科技大学 林学 院，河南 洛 阳 471003； 3．中国洛阳国家牡丹基因库 ，河南 洛 阳 471006) 摘要 ：根据 GenBank登录的牡丹ACS基 因DNA全长序列 (FJ769773)，设计一对特异性 引物 ，在优化 的PCR扩增 体系的基础上，应用高保真 DNA聚合酶 KOD·Plus从洛阳红牡丹叶片总DNA 中扩增 出牡丹ACC合成酶基因片段 PsACS-4。测序结果表明：克隆序列长 970hp，不包含牡丹ACS基因内含子序列，与 目标序列同源性达 100％：用 SacI 和 SmaI对重组质粒和空载体 pBI121双酶切 、连接 ，将 PsACS-4基 因片段反身插入到植物表达载体 pBIl2l的35S启 动子下游 ，成功构建 了牡丹ACS反义基 因植物表达载体。 关键词 ：牡丹 ；ACC合成酶 ；反义植物表达载体 中图分类号 ：$685．11；Q78 文献标识码 ：A 文章编号：1000—7091(2010)O6—0034一O4 CloningofACCSynthaseGenefromPaeoniasuffruticosaand ConstructionofAntisensePlantExpressionVector FANBing—you，GAOShui—ping，LIUGai—xiu ，SHIGuo—an ，LIJia．jue，KONGXiang—sheng (1．CollegeofAgronomy，LuoyangKeyLaboratoryofPeonyBiology，HenanUniversityof ScienceandTechnology，Luoyang 471003，China； 2．CollegeofForestry ，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang 471003，China； 3．LuoyangNotationalPeonyGeneticStorehouse，Luoyang 471006，China) Abstract：AccordingtotheDNAfull—lengthsequenceofACCsynthasegenerfagmentofPaeoniasuffruticosa (FJ769773)inGenBankdatabase，apairofspecificprimers，P1andP2，weredesignedandsynthesized．Basedonthe optimizedPCR amplification system andhighfidelityDNA polymeraseKOD-Plus，ACSgenefragmentPsACS-4 was successfullyamplifiedfrom thetotalDNA whichwasextractedfrom leavesofpeonycuhivarLuoYangHong．Sequen— eingresultindicatedthatthelengthofPsACS-4rfagmentwas970bp，andthesimilarityofthesequenceofPsACS-4 and the tarffetsequencewas1OO％ ．Twosequencesalignmentanalysisrevealed thatsequenceofPsACS-4 didn tcon— tainanyintronsequence．TherecombinantplasmidandtheplantexpressionvectorpBI121weredigestedwiththeSac IandSma Idigestenzyme．AftertherfagmentofACC synthasegeneandpBI121wererecov