人骨形态发生蛋白4在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究.pdfVIP

药 物 生 物 技 术 302 PharmaceuticalBiotechnology 2014，21(4)：302～305 人骨形态发生蛋 白4在 中国仓 鼠卵巢细胞中的表达研究 蒋梅琴，邓春梅，曾永芬，黄义德 (福建省发育与神经生物学重点实验室 ，福建师范大学 生命科学学院，福建 福州350108) 摘 要 为了在中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)中表达人骨形态发生蛋 白4(hBMP4)，构建 hBMP4重组表达质粒 并电转至CHO／DG44细胞中。经 RT—PCR和Westernblot检测，确定整合到 CHO细胞基因组 中的hBMP4序列能 转录并表达hBMP4蛋白，表达的重组蛋白以二聚体和单体形式存在。利用氨甲喋呤逐步筛选具有较高拷贝数的 细胞。抗氨甲喋呤的CHO细胞进一步通过有限稀释法筛选稳定高表达的细胞系。与筛选前相比，hBMP4在CHO 细胞中的表达得到显著提高 (从 24ng／mL提高到 583ng／mL)。碱性磷酸酶活性测定表明CHO细胞表达的 hBMP4具有生物活性。成功构建了能表达hBMP4的CHO细胞株，这为hBMP4的结构和功能以及临床前的研究 提供了另一种可供选择的途径。 关键词 人骨形态发生蛋白一4；中国仓鼠卵巢细胞；重组表达；氨甲喋呤；有限稀释 ；筛选 中图分类号 Q81 文献标志码 A 文章编号 1005—8915(2014)04—0302—40 骨形态发生蛋 白(BoneMorphogenetieProteins，BMPs) 性小于哺乳动物中表达的具有天然构象的hBMP4蛋白 。 是一类属于TGF—B超家族的蛋 白质生长因子。其中，骨形 本研究 中我们探讨利用 中国仓 鼠卵巢 (CHO)细胞表达 态发生蛋白一4又称骨形态发生蛋白2B，它在心、脑、肺、肾、 hBMP4，通过氨甲喋呤加压扩增 hBMP4拷贝数及结合有限 骨和软骨等重要组织器官中表达，参与调控细胞的增殖、分 稀释法筛选稳定高表达 hBMP4细胞株 ，并对表达的重组 化及早期胚胎发育等过程。在促进骨修复方面，发现 BMP4 hBMP4进行生物活性检测。 能促进脊柱融合…，促进骨质疏松性骨折愈合及治疗临界 1 材料与方法 骨缺失 ，体 内外实验都证明 BMP4能促进间充质干细胞 向成骨细胞分化 ；研究发现先天性心脏病可能与 BMP4 1．1 材料 的异常表达有关，注射可溶性的BMP2或BMP4都能诱导 含有编码人骨形态发生蛋白(hBMP4)基因的重组质粒 心脏的分化 ，同时，BMP4是造血微环境的关键因子 ，调 pBluescript—hBMP4、NIH3T3细胞保存于福建师范大学生命 控造血干细胞的数 目和功能 ，实验证明人类胚胎干细胞 科学学院发育与神经生物学实验室；pOptiVECTM．TOPO~ 在 rhBMP4诱导下可以朝着造血细胞和心肌细胞分化 。 TAVectorKit(12744．017)、二氢叶酸缺陷型中国仓 鼠卵巢 因此，BMP4在器官再生及修复等临床应用上具有广泛 细胞 (ChineseHamsterOvary，CHO，CHO／D C44)购 自 前景。 Invitrogen公司；TaqDNA聚合酶、DNA限制性 内切酶、T4 BMP4在生物体中表达量低，要想得到大量的BMP4用 DNA连接酶等工具酶为 TaKaRa公司产品；WizardDNA 于临床，必需通过基因工程技术进行重组表达。王欣璐等 Clean—Up核酸纯化试剂盒购于Promega公司；rhBMP4和an． 用大肠杆菌表达人 BMP4(hBMP4)，表达 的重组蛋白以包 ti—hBMP4抗体购 自RD公司，碱性磷酸酶修饰的二抗购自 涵体的形成存在 。蛋白的构象对蛋白的活性至关重要。 福州中杉金桥生物技术有限公司；DMEM、胎牛血清和 ．谷 天然的BMP4是一种二聚体糖蛋白，因此，在大肠杆菌中表 氨酰胺购于