pcDNA3_1_NT_GFP小凹蛋白1及突变体表达载体的构建及功能分析.pdfVIP

CN 431262/ R 中国动脉硬化杂志 2005 年第 13 卷第 3 期 297 ( ) [文章编号] 2005 1303029704 ·实验研究 · pcDNA3 . 1/ NTGFP 小凹蛋白 1 及突变体表达 载体的构建及功能分析 1 1 ,2 1 1 1 ,2 徐阳炎 , 杨慧龄 , 涂 　剑 , 何淑雅 , 廖端芳 ( 1. 南华大学药物药理研究所 , 湖南省衡阳市 421001 ; 2 . 中南大学药学院 , 湖南省长沙市 410078) [ 关键词] 　分子生物学 ; 　小凹蛋白 1 ; 　突变体 ; 　克隆; 　聚合酶链反应 [摘 　要] 　目的　构建 pcDNA3 . 1/ NTGFP 小凹蛋白 1 及对突变体表达载体及表达蛋白生物活性进行分析 。方法 　采用硫化修饰引物与 Pfu 酶结合的高度保真性聚合酶链反应体系 , 自行设计多对引物 ,分别扩增带 His 标签的小 ( ) ( ) 凹蛋白 1 全长 目的片段 、小凹蛋白 1 缺失 81～101 位氨基酸 突变体 1 片段及小凹蛋白 1 缺失 143～156 位氨基酸 突变体 2 片段 ;分别亚克隆入pcDNA3 . 1/ NTGFPTOPO 真核表达载体 ,转化 TOP10 E. coli 大肠杆菌 ,在含氨苄的固体 LB 培养基上随机挑取 6 个克隆 ,分别提取质粒后 ,用 PCR 法筛选含正确插入阅读框的阳性克隆子并测序鉴定 。用 脂质体介导法瞬时转染入 Hep G2 细胞 ,用MTT 法 、Western blot 法初步鉴定 GFPHis 小凹蛋白1 及突变体重组融合蛋 白的生物学活性 。结果 　筛选得到正确 pcDNA3 . 1/ NTGFPHis 小凹蛋白 1 及突变体表达载体 ,测序结果无碱基突 变及阅读框移码 , GFPHis 小凹蛋白 1 及突变体重组融合蛋白具有天然表达蛋白相似的生物学活性 。结论 　成功 构建具有生物学活性的pcDNA3 . 1/ NTGFP 小凹蛋白 1 及突变体表达载体 ,为小凹蛋白 1 的功能研究奠定基础 。 [ 中图分类号] 　Q7 [文献标识码] 　A Construction , Identif ication and Primary Functional Analysis of pcD NA3. 1/ NTGFP Caveolin1 and Mutants Plasmids XU YangYan1 , YAN G HuiLing1 ,2 , TU Jian1 , HE ShuYa1 ,2 , and LIAO DuanFang1 ( 1. Institute of Pharmacology and Pharmacy , N anhua University , Hengy ang 421001; 2. Dep artment of Pharmacology , School of Pharmaceutical Science , Centeral South University , Changsha 410078 , China)