香菇C91-3发酵液蛋白的初步分离及其体外抗肿瘤作用检测.pdfVIP

山东医药2009年第49卷第45期 香菇 C91．3发酵液蛋 白的初步分离及其 体外抗肿瘤作用检测 王晓丽，赵 越 ，李星云，曹 婧，宁安红。黄 敏 (大连医科大学，辽宁大连 116044) 摘要：目的 探讨香菇C91．3发酵液蛋白(LFP91．3)的有效抗肿瘤成分及抗肿瘤作用。方法 根据分子量对 LFP91—3进行分组，分别测定各组的抗肿瘤活性，并检测效应组对细胞凋亡的影响。结果 LFP91—3分为A、B、c三 组 ，三组蛋白浓度分别为 131．25、75．96、435．05mg／ml。各组均有抗肿瘤活性，c组活性最强，并可诱导H22细胞 凋亡。结论 LFP91．3在体外有 良好的抗肿瘤作用。 关键词 ：香菇 C91—3发酵液蛋 白；细胞凋亡 ；抗肿瘤药，植物 中图分类号：R730．5 文献标志码 ：B 文章编号：1002~66X(2009)45—0073-O2 前期试验证 明，香菇 C91—3发酵液具有 良好的 1．4 肿瘤细胞凋亡的检测 抗肿瘤 、抗菌作用 ¨-3]。香菇 C91．3发酵液中除含 1．4．1 电镜检查 对数生长期的H22细胞，调整 有大量多糖和氨基酸成分外，还含有多种蛋 白成分。 浓度至5X10个／ml，加入 C组蛋白，使其终浓度为 2005年 l0月 一2008年 1月，本课题组对香菇 C91-3 5 ml，混匀37cCl孵育24h后，收集肿瘤细胞，按 发酵液蛋白(LFP91—3)进行了初步分离并进行体外 透射电镜的常规方法制片观察。 抗肿瘤实验研究。 1．4．2 流式细胞术检测 对数生长期的H22细 1 材料与方法 胞，调整浓度至 1×10。／ml，加入 C组蛋 白，使其终 1．1 材料 香菇 C913菌丝发酵液、香菇 C91—3菌 浓度分别为25、50、75 g／ml，37oC分别孵育24、48 株由大连理工大学食用菌研究中心惠赠。瘤株 ： 及72h。同浓度的正常培养24h的H22细胞作阴 H22(小鼠腹水型肝癌细胞株)、U14(小 鼠腹水型宫 性对照。按试剂盒说明进行 Annexin／PI双染 ，FACS 颈癌细胞株)、S180(小 鼠腹水型肉瘤细胞株)。 Vantage流式细胞仪检测。 SephadexG一100 (Pharmacia分装)；Annexin／PI染液 1．5 统计学方法 使用 SPSS13．0分析软件，计数资 (BD公司)；FACSVantage流式细胞仪。 料比较采用 检验。P≤0．05为差异有统计学意义。 1．2 LFP91—3的提取与初步分离 4~C下离心、过 2 结果 滤、硫酸铵盐析发酵液，透析除盐后真空干燥浓缩。 2．1 各组蛋白的抑瘤率 对于U14细胞，C组效果 以SephadexC一100柱层析 (100×0．5cm柱)，PBS 最好，处理72h后，C组显著高于其他蛋 白组 [tT (pH7．3)洗脱 。根据洗脱 曲线可将 LFP91—3分为 (df)0．O1]，l5 mlc组蛋 白抑制效果高于环磷 A、B、C三组，A组蛋 白浓度为 131．25mg／ml，B组 酰胺(CTX)[tT(df)0．05]。对于S180细胞，B、c 为75．96mg／ml，C组为435．05mg／ml。钴 60照射 两组均具有较好的抑制效果 ，处理72h后 ，B、C的 灭菌后4cC保存备用。 抑制效果明显高于A组蛋 白[tT(df)0．O1]，但均 1．3 LFP91—3体外抗肿瘤活性的检测 选对数生 不超过 CTX的抑制效果 [tT(df)0．05]。对于 长期的H22、S180、U14细胞调整浓度至 1×10个／ H22细胞，c组的抑瘤率显著高于A、B及总蛋 白组 ml，加入96孔板每孔 100 l；分别加人5、10、l5 [￡T(df)O．O1]；处理48及72h后，C组的抑制效 ml的A、B、C组 LFP91—3100 l，设 3个复孔 ；37oC 果显著高于CTX的[t (df)0．O1]。可见，对于这 分别孵育24、48及72h后，加人M1Tr使其终浓度为