阿托品拮抗豚鼠回肠M受体的pA2测定.docxVIP

实验六阿托品拮抗豚鼠回肠M受体的pA2测定[实验目的] 1. 通过实验了解离体平滑肌基本实验方法；2. 观察阿托品对豚鼠回肠M受体竞争性拮抗作用。[实验动物]豚鼠，体重300g左右，雄性。[实验药品] 1.乙酰胆碱（2*10-5,2*10-4,2*10-3,2*10-2，2*10-1,2mol/L）2.阿托品（5*10-5,5*10-4,5*10-3mol/L）3.台氏液[实验器材]100ul微量注射器、培养皿、眼科镊、持针器、缝针、缝线、洗瓶、吸管、肌力换能器、HSS-1(B)型恒温浴槽、RM6240生物信号采集处理系统。[实验方法]仪器安装调试：搭建好仪器后，打开水浴锅电源，使浴槽温度保持在37℃，清洗水浴槽后，加入台氏液20ml，通气，使气泡呈碎花状释放；启动计算机，双击RM6240生物信号采集处理系统，打开“阿托品拮抗豚鼠回肠M受体的pA2测定”，设置好实验参数，使软件处于示波状态。标本准备：取豚鼠回肠2—2.5cm，（制备详见附录），用丝线将肠管对角结扎（不要封闭肠腔），一端固定在浴槽的通气钩上，另一端垂直连接于肌力换能器的感应片上，调节基础张力约为0.5g。肠管在槽内稳定15min后，记录正常收缩活动。观察项目：未加阿托品时每个ACh累集浓度引起的肠管最大收缩幅度；分别加入阿托品（3个浓度）后，每个ACh累加浓度引起的肠管最大收缩幅度。给药方案：用微量注射器或微量加样枪像麦氏浴槽内从低到高加入ACh以累加摩尔浓度（mol/L）递增，当每个浓度引起肠管收缩反应达到最大时，立即累加另一个浓度，直到收缩反应不再增加，即达最大反应，制作ACh量效曲线；用台氏液冲洗标本3—5次，稳定10min后，加入5*10-5mol/L的阿托品20ul，使其终浓度为5*10-8mol/L，重复步骤（1）；上述离体回肠经冲洗恢复正常后，加入5*10-4mol/L的阿托品20ul，使其终浓度为5*10-7mol/L，重复步骤（1）；上述离体回肠经冲洗恢复正常后，加入5*10-3mol/L的阿托品20ul，使其终浓度为5*10-6mol/L，重复步骤（1）。数据处理数据保存实验结束，点击“停止示波”，保存文件，对文件进行编辑，选择预览键删除不需要的页面，注意应另外备份一份原始数据以防编辑时发生错误而丢失数据。使用“反演”键选择适当的记录进行编辑，若太长，可调节通道右侧“扫描速度”键，将波形压密。点击“分析”栏，选择“区域测量”，测量每个ACh累计浓度下肠管收缩引起基线上移的累积高度。所得结果列于表中，以ACh引起最大收缩高度为分母，求每个ACh浓度下收缩高度与最大收缩高度的比值E/EMAX。在“文件”栏中选择“打印模式设计”栏的“当前整体打印”、“学生实验”；“实验”栏的“实验信息”，输入院系（姓名）、班级和学号，编辑完成后，使用“预览打印”进行检查，确认无问题后打印结果。结果处理绘制乙酰胆碱累积量效关系曲线：以乙酰胆碱引起的最大收缩幅度为100%，计算加入不同剂量乙酰胆碱后的张力变化百分率填入表一，并以此为纵坐标，以乙酰胆碱的摩尔浓度为横坐标，作图画出量效曲线，并求出每条ACh量效曲线的EC50；根据改良的Linewaver-Burk公式可知[C]/E=KD/Emax+1/Emax[C]……….(1)以ACh浓度[C]为X，以每个ACh浓度与其引起收缩强度的比值[c]/E为Y，进行直线回归，求出每条ACh量效曲线的直线回归方程Y=a+bX根据公式（1）可知，a/b=KD/Emax*Emax=KD（此处KD相当于EC50，由此可得在阿托品浓度为0、5*10-8、5*10-7、5*10-6mol/L的ACh量效曲线的EC50值分别为EC50a,EC50b,EC50c,EC50d。求出每个阿托品浓度下的AChEC50与无阿托品时AChEC50的比值。X1=EC50b /EC50a, X2=EC50c /EC50a, X3=EC50d/EC50a C.找出阿托品的PA2根据Schild方程 PAX=-lg[B]-lg(Xi-1)当X=2时，lg(Xi-1)=0, 此时-lg[B]=PA2因此可用Schild作图法求PA2,比单点法更准确：以lg(Xi-1)为纵坐标，阿托品浓度负对数-lg[B]为横坐标作图，将每个-lg[B]对应的lg(Xi-1)值的连线与横轴的交点即为PA2值。表一乙酰胆碱累积给药及张力变化Ach浓度加药量 Ach终浓度负对数加入阿托品后张力变化E/Emax(%)（mol/L） ul （mol/L）（-log） 0 5*10-85*10-7 5*10-62*10-5 10 10-88 21.3 50.0