卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv／鼠HSP70融合蛋白复性条件的研究.pdfVIP

424 中国医药生物技术 2009年 l2月第4卷第 6期 ChinMedBiotechnol，December2009，Vo1．4，No．6 DOI：10．3969／cmba．j．issn．1673-713X．2009．06．005 ·论 著 · 卵巢癌抗独特型单链抗体 6B11ScFv／鼠HSP70 融合蛋白复性条件的研究 张果，昌晓红，成夜霞，叶雪，程洪艳 ，魏丽惠，崔恒 【摘要 】 体存在 ，得到有活性的 目的蛋白需要在体外进行复 目的 探讨大肠杆菌表达的卵巢癌抗独特型单链抗体／d,鼠 性。然而，由于不同蛋 白理化性质不同，复性方法 热休克蛋 白 70(6B11ScFvm／HSP70)融合蛋 白包涵体变性、 和条件存在很大差异，因此体外复性蛋白成为一项 复性条件，以确定其最佳体外复性条件。 艰巨的任务[Jj；同时建立融合蛋 白的高效复性程序 方法 大肠杆菌表达大量融合蛋白 6B11ScFv／mHSP70：① 也成为科研、医疗和工业生产中应用融合蛋白的关 比较不同的裂解液 (8mol／L尿素和 6mol／L盐酸胍)对包 键环节。卵巢癌抗独特型单链抗体／4,鼠热休克蛋 白 涵体的裂解效率及其对复性蛋白活性的影响；②探索序贯稀 70(6B11ScFv／mHSP70)重组蛋白是北京大学人民 释方法，以及氧化还原环境和复性液中不同浓度 L一精氨酸 医院妇科肿瘤中心构建的卵巢癌抗独特型抗体融 对蛋白稀释复性的影响；③比较稀释复性和柱 复性对融合 合疫苗，经体内外研究证实，具有诱导有效抗卵巢 蛋白复性效率及活性的影响。采用 Bradford法测定包涵体 癌免疫反应 的能力 j，有望进一步应用于卵巢癌的 裂解液与复性后蛋白浓度。所有复性蛋 白活性的检测均采用 免疫治疗，但大规模制备活性较好的该蛋白尚存在 ELISA方法。 困难 。本研究拟采用大肠杆菌表达系统制备 结果 以包涵体形式表达 6B11ScFv／mHSP70蛋白：①经 6B11ScFv／mHSP70融合蛋 白，探讨其包涵体的变 6molL／盐酸胍裂解包涵体的效率远高于 8mol／L尿素，但 性、复性条件，以确定最佳复性和纯化条件，为规 前者复性所得蛋白活性低，6mol／L盐酸胍彻底裂解的包涵 模化生产奠定基础。 体经 8molL／尿素透析后再复性，复性效率显著提高；② 序贯稀释方法可提高蛋 白复性效率；加入 0．5mol／LL一精氨 1 材料与方法 酸可降低稀释复性过程中蛋白聚集物的产生，提高复性效 1．1 材料 率；加入还原型谷胱甘肽 (GSH)与氧化型谷胱甘肽 (GSSH) 1．1．1 质粒和菌种 质粒 pET30a(+)．6B11ScFv／ 浓度比为 1：5时，可提高复性后蛋 白活性；③柱上复性可 mHSP70 由北京大学人 民医院妇科肿瘤 中心构 一 步完成蛋白的复性和纯化，所得蛋白纯度较高，但复性效 建L2J；表达菌 E．coliBL21(DE3)购 自德国Novagen 率和复性后蛋 白活性较稀释复性低。 公司。 1．1．2 主要试剂和仪器 小鼠抗 HSP70抗体购 结论 本研究建立了 6B11ScFv／mHSP70融合蛋 白的最 自美国 BDBiosciencesPhanningen公司；卵巢癌 佳复性条件：包涵体经 6mol／L盐酸胍彻底裂解后，再经 单抗 COC166—9 由北京大学人 民医院妇科肿瘤中 8mol／L尿素透析，然后进行序贯稀释复性，且复性液中加 心制备；HRP羊抗鼠 IgG购 自北京中杉金桥生物 入 0．5mo